超高效液相色譜-串聯質譜法檢測動物肌肉組織中19種β-受體激動劑殘留

李 丹，孫 雷，畢言鋒，蘇富琴，徐秉恩，王鶴佳，徐士新

(中國獸醫藥品監察所國家獸藥殘留基準實驗室，北京100081)

β-受體激動劑(β-agonists)是一類化學合成的苯乙醇胺類物質，在飼料中添加該類藥物給動物飼喂后具有營養再分配作用，可以明顯提高動物的瘦肉率，但是人們食用了這些藥物殘留的畜禽產品后會出現面色潮紅、頭痛、頭暈、胸悶、心悸、四肢麻木等不良反應癥狀，嚴重的可能危及生命。因此國際上很多國家先后立法禁止在畜禽生產上使用該類藥物，我國政府也明令禁止其使用。近年來，隨著班布特羅、齊帕特羅等其它種類的β-受體激動劑在養殖等環節非法添加使用的出現，2010年農業部1519號公告再次禁止在飼料和動物飲水中使用氯丙那林、齊帕特羅等新型的β-受體激動劑，但農業部現行的1025號公告-18-2008僅能對動物肌肉組織中9種β-受體激動劑進行檢測，給違禁使用新型β-受體激動劑的查處造成不便。本研究針對我國居民消費量比較大的豬、牛和羊肌肉組織樣品，研發一種能快速準確檢測其中19種β-受體激動劑殘留的UPLC-MS/MS檢測方法，為行政主管部門對市場上已經出現和可能出現的其他種類新型的β-受體激動劑進行有效監管提供技術支撐，滿足多種β-受體激動劑同時檢測的要求。

1 材料與方法

1.1 儀器 Acquity UPLC-Quattro premier XETM質譜聯用儀(Waters公司);DKZ-2型電熱恒溫振蕩水槽(上海精宏實驗設備公司);Delta 320 pH計(Mettler Toledo公司);Biofuge Strators高速冷凍離心機(賀利氏公司);Organomation Associates氮吹儀(Jnc公司);SIR4漩渦混合器(IKA公司)。

1.2 試劑和材料 吡布特羅、西馬特羅、特步他林、齊帕特羅、沙丁胺醇、西布特羅、克倫塞羅、克倫丙羅、羥甲基克倫特羅、氯丙那林、萊克多巴胺、克倫特羅、妥布特羅、福莫特羅、溴布特羅、克倫潘特、班布特羅、馬布特羅、馬噴特羅，西馬特羅-D7，沙丁胺醇-D3，萊克多巴胺-D3，克倫特羅-D9，班布特羅-D9，克倫潘特-D5，克倫丙羅-D7純度均大于98.0%(Dr.Ehrenstorfer公司);乙腈、異丙醇、甲酸為色譜純(Fisher公司);NaCl、Na2SO4和MgSO4均為分析純;所用水為超純水。

1.3 對照溶液配制 精密稱定適量的吡布特羅、西馬特羅、特步他林、齊帕特羅、沙丁胺醇、西布特羅、克倫塞羅、克倫丙羅、羥甲基克倫特羅、氯丙那林、萊克多巴胺、克倫特羅、妥布特羅、福莫特羅、溴布特羅、克倫潘特、班布特羅、馬布特羅和馬噴特羅對照品，用甲醇配制成1 mg/mL的各標準儲備液。準確吸取0.1 mL的各標準儲備液至同一10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，即得10 μg/mL的混合標準工作液。

精密稱定適量的西馬特羅-D7，沙丁胺醇-D3，萊克多巴胺 -D3，克倫特羅 -D9，班布特羅 -D9，克倫潘特-D5和克倫丙羅-D7，用甲醇配制成1 mg/mL的各內標儲備液。準確吸取0.1 mL的各內標儲備液至同一10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，即得10 μg/mL的混合內標工作液。

1.4 樣品前處理 準確稱取勻質的豬、牛和羊肌肉組織(5±0.05)g，置于50 mL離心管內，加入8 mL乙腈和2 mL異丙醇，渦旋1 min。加入1.2 g氯化鈉，渦旋1 min，再加入4 g Na2SO4和0.5 g MgSO4，渦旋后水平振蕩 5 min，靜置 5 min，8000 r/min離心8 min。離心后取5.0 mL上清液于玻璃離心管內，50℃下氮氣吹干，然后用10%甲醇水溶液0.5 mL充分溶解后，供超高效液相色譜-串聯質譜法測定。

1.5 儀器分析條件 色譜柱為BEH C18(100 mm×2.1 mm，1.7 μm);流動相A相為0.1%甲酸乙腈溶液，B相為0.1%甲酸水溶液，梯度洗脫:0～2 min，維持4%A;2～12 min，4%A線性變化至60%A;12～13 min，維持 4%A;流速為0.3 mL/min;柱溫為30 ℃;進樣量為10 μL。

電噴霧離子源(ESI+);毛細管電壓為3.2 kV;源溫為110℃;脫溶劑溫度為350℃;脫溶劑氣速為650 L/Hr;錐孔反吹氣速為50 L/Hr。多反應監測離子情況見表1。

2 結果

2.1 標準曲線與線性范圍 準確量取適量的西馬特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺、克倫特羅、班布特羅、克倫潘特、克倫丙羅7種混合標準工作液和內標工作液，制得濃度為 2、5、10、20、50 ng/mL 的系列標準工作溶液(內標濃度為10 ng/mL)，依次上機測定，以各藥物定量離子質量色譜峰面積與對應的內標峰面積比值為縱坐標(y)，標液濃度為橫坐標(x)，繪制標準曲線(表2)。可以看出7種β-受體激動劑在2～50 ng/mL的系列標液濃度范圍內呈現良好的線性關系，相關系數(r2)均大于0.99。

其他12種β-受體激動劑取其混合標準工作液適量，分別添加到空白肌肉組織經前處理后的基質中，制得濃度為 2、5、10、20、50 ng/mL 的系列基質匹配標準溶液，依次上機測定。以各藥物定量離子質量色譜峰面積為縱坐標(y)，基質匹配標準溶液濃度為橫坐標(x)，繪制標準曲線(表2)。可以看出12種β-受體激動劑在2～50 ng/mL的系列濃度范圍內呈現良好的線性關系，相關系數(r2)均大于0.99。

表1 19種β-受體激動劑及內標監測離子對、對應的錐孔電壓和碰撞能量

表2 19種β-受體激動劑標準曲線及相關系數

2.2 方法靈敏度 采用空白添加目標化合物的方法，依據特征離子質量色譜峰信噪比S/N＞3為方法檢測限，S/N＞10為方法定量限，得出吡布特羅、西馬特羅、特步他林、等19種藥物在豬、牛和羊肌肉組織中的定量限為0.5 μg/kg，檢測限為0.25 μg/kg。

1 μg/kg空白豬肌肉添加試液中19種β-受體激動劑特征離子質量色譜圖見圖1。

圖1 1 μg/kg空白豬肌肉添加試液中19種β-受體激動劑特征離子質量色譜圖

2.3 方法精密度與準確度 在空白豬肌肉中添加0.5、1、5 μg/kg三個不同濃度的19種 β-受體激動劑進行回收率試驗，結果匯總見表3。可以看出，19種β-受體激動劑在空白豬肌肉組織中的平均添加回收率為73.7% ～114.1%，批內批間相對標準偏差均小于20%。

表3 空白豬肌肉中19種β-受體激動劑添加回收率實驗結果(n=5)

3 討論

β-受體激動劑在養殖業上屬于禁用藥物，對于此類藥物，只要在動物性食品中檢出即為非法添加，已報道的文獻[1-7]資料中，此類藥物的分析方法都包括酶解、液液萃取、固相萃取凈化等繁瑣的前處理過程，藥物絕對回收損失較大，且耗時較長。因此，本方法采用乙腈和異丙醇(4∶1，V/V)為提取溶劑進行提取，對于苯胺型、苯酚型及間苯二酚型的藥物均有好的提取效果。此外，方法中加入NaCl、Na2SO4和MgSO4，具有很好的鹽析沉淀蛋白、去雜、吸收水分等作用，起到了很好的樣品凈化效果。本方法縮短了樣品前處理時間，能更好地滿足快速確證檢測的需求。

4 結論

試驗通過對我國居民經常消費的豬、牛和羊肌肉組織樣品前處理條件的優化改進，建立了快速檢測動物肌肉組織中19種β-受體激動劑殘留檢測的UPLC-MS/MS方法，其靈敏度、精確度均能滿足獸藥殘留分析方法的要求，同時也為我國市場上已經出現和可能出現的其他種類新型的β-受體激動劑實施監管提供了技術支撐。

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