免疫印跡法檢測胰島自身抗體系列在糖尿病分型診斷中的應用

邱 陽 郭慧淑 劉越堅 單路娟 郭 莉 (大連醫科大學附屬第一醫院中心實驗室，遼寧 大連 116011)

糖尿病的早期診斷和分型在其治療和預后中顯示出十分重要的作用。1型糖尿病(T1DM)是由于自身免疫損傷胰島β細胞，從而使胰島素敏感性降低或分泌減少的疾病。患者體內存在多種針對胰島β細胞的自身抗體，其中血清谷氨酸脫羧酶抗體(GADA)、抗胰島β細胞抗體(ICA)、抗胰島素自身抗體(IAA)是極為重要的三種指標〔1〕，其地位和作用已得到認可。本文應用免疫印跡法(IB)聯合檢測上述三種抗體，分析并探討其對糖尿病分型診斷的意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 實驗組為2008年3月至2012年12月來本院內分泌科就診的門診及住院患者187例，其中T1DM 69例，男39例，女30例，年齡11～40〔平均 (23±12)〕歲;2型糖尿病 (T2DM)118例，男62例，女56例，年齡33～72〔平均 (52±18)〕歲，半年內未用胰島素。所有病例均經臨床及實驗室檢查后按1999年WHO糖尿病診斷標準確診，并排除繼發性和妊娠糖尿病。健康對照組為2011年9月來本院體檢的健康者30例，其中男13例，女17例;年齡25～57〔平均 (41±14)〕歲，空腹血糖均在正常范圍內，且無糖尿病家族史和自身免疫病史。

1.2 方法

1.2.1 采血 清晨空腹采靜脈血，37℃放置 30 min，3 000 r/min離心10 min，分離血清，－20℃保存備用。

1.2.2 抗體測定 采用免疫印跡法測定GADA、ICA、IAA，試劑盒購于深圳伯勞特生物制品有限公司。操作過程:(1)取出試劑盒，室溫平衡。在含有印跡膜條的反應槽中加入1 ml工作液，水平振蕩5 min后加入待檢血清 10 μl，再次水平振蕩30 min。(2)棄去槽中液體，每槽中加入1 ml洗滌應用液洗滌5 min，棄去液體。重復洗滌三次。(3)每槽中加入1 ml工作液及20 μl酶聯試劑，水平振蕩器上振蕩0.5 h。(4)洗滌同步驟(2)。(5)每槽中加入顯色劑1 ml，水平振蕩器上振蕩10 min。(6)顯色清楚后，棄去顯色劑液，用自來水反復沖洗。(7)取出印跡膜條，晾干后與標準帶對照判定結果。

1.3 統計學方法 應用SPSS13.0軟件行χ2檢驗。

2 結果

免疫印跡法檢測69例TIDM型糖尿病患者，其中GADA陽性45例(65.22%)，ICA陽性37例(53.62%)，IAA陽性20例(28.99%)。在118例T2DM型糖尿病患者中，GADA陽性15例(12.71%)，ICA陽性 13例(11.02%)，IAA陽性 7例(5.93%)。在30例健康體檢者中，只有ICA陽性1例，其余均為陰性。由此可見，T1DM組胰島自身抗體的陽性檢出率明顯高于T2DM組及正常對照組(P＜0.05)。在T1DM組中，3種抗體檢出的陽性率依次為GADA＞ICA＞IAA，同時3種抗體聯合檢測的陽性率也明顯高于單項檢測(P＜0.05)。

3 討論

糖尿病是一種代謝綜合征，在臨床上常見且多發。糖尿病分型方法雖經多次修訂〔2～4〕，但仍然不盡如人意。最常用的是按照世界衛生組織及國際糖尿病聯盟專家組的建議，將糖尿病按病因分型分為1型、2型、其他特殊類型及妊娠糖尿病4種〔5〕。以往主要依據患者臨床表現和血清胰島素水平，這種分型方法對成人隱匿性免疫糖尿病(LADA)不易察覺，具有一定的局限性。近年來隨著糖尿病免疫標志物的出現，臨床分型有依賴于血清免疫標志物檢測的趨勢。目前用于糖尿病診斷的血清免疫標志物主要有 GADA、ICA、IAA〔6〕。

T1DM患者在無癥狀以及發病后一段時期內可檢出多種針對胰島β細胞的自身抗體，如GADA、ICA、IAA、酪氨酸磷酸酶抗體(IA)等，每一種抗體和T1DM的發生、發展都密切相關。GADA是合成γ氨基丁酸(GABA)的限速酶，在胰島β細胞中與胰島素同時存在，在患者出現T1DM臨床表現前數年甚至10余年即可出現，與β細胞慢性損傷的相關性好、持續時間長、陽性率高〔7〕。作為LADA預測的早期診斷指標，ICA是針對胰島細胞內具有的胞質成分多種抗原的混合抗體，當這種抗體和胰島細胞的表面抗原結合后可引起免疫反應，激活補體系統，最終引起細胞的溶解和死亡而導致糖尿病;新發的T1DM中陽性率為65%～85%，隨著病程延長，陽性率逐漸降低。因此對少年起病的T1DM早期有較高的診斷價值〔8〕。IAA是針對內源性胰島素的抗體，也是唯一針對胰島β細胞的一類特異性抗體。在糖尿病自身抗體中，IAA出現最早，持續時間較短〔9〕。有國外文獻報道，經典T1DM患者IAA陽性率可達70%〔10〕，對T1DM診斷有較好的敏感性。IAA絕大部分與胰島素結合成復合物而使其失去生物活性，因此IAA的測定能為治療糖尿病提供重要依據，也是評價藥用胰島素的理想指標。

目前主要是采用放射免疫法、放射配體法、酶聯免疫法等檢測糖尿病分型的抗體。本組研究采用的免疫印跡技術是將凝膠電泳(SDS-PAGE)的高分辨率和免疫學反應的高特異性有效結合的一種新的分子生物學免疫技術。此方法首先利用聚丙烯酰胺凝膠電泳將生物活性物質高效分離，然后通過電轉移將其轉印在硝酸纖維膜 (NC膜)上，與待檢血清反應，若血清中含有相應抗體，則抗原抗體結合，再分別加入酶聯二抗和顯色劑，相應抗原位置即出現顯色區帶，與標準區帶比較，判定結果。該方法即保持了高分辨率又不失去原有抗原性，以便進行各種生物控制、免疫識別、掃描和保存。具有不同分子量的抗原包被于同一印記條，可以同時聯合檢測ICA、GADA、IAA 3種自身抗體，提高檢出率〔11〕，而且無需特殊設備，操作簡單方便，時間短，重復性好，是糖尿病自身抗體檢測的一種簡便有效的方法。本研究顯示，免疫印跡法檢測T1DM組GADA、ICA、IAA陽性率明顯高于T2DM組和對照組，說明三種抗體是鑒別T1DM和T2DM及預測和早期診斷T1DM的重要指標。

1 郭 莉，單路娟，邱 陽，等.糖尿病患者血清GAD-Ab、ICA、IAA聯合檢測的臨床意義〔J〕.大連醫科大學學報，2004;26(2):136-8.

2 Dellinger RP，Carlet JM，Masur H，et al.Surviving sepsis campaign guidelines for management of severe sepsis and septic shock〔J〕.Crit Care Med，2004;32(3):858-73.

3 Annane D，Maxime V，Ibrahim F，et al.Diagnosis of adrenal insufficiency in severe sepsis and septic shock〔J〕.Am J Respir Crit Care Med，2006;174(12):1319-26.

4 Cooper MS，Stewart PM.Corticosteroid insufficiency in acutely ill patients〔J〕.N Engl J Med，2003;348(8):727-34.

5 《中國糖尿病防治指南》編寫組.中國糖尿病防治指南〔M〕.北京:北京大學醫學出版社，2004:223.

6 張士榮，崔 琢，周 靜.GAD-Ab、ICA檢測在糖尿病分型診斷中的臨床價值〔J〕.中華全科醫學，2008;6(12):1299-300.

7 朱禧星.現代糖尿病學〔M〕.上海:上海醫科大學出版社，2000:1-95.

8 趙成玉，高繼東.谷氨酰脫羧酶抗體和胰島細胞抗體測定的臨床意義〔J〕. 青海醫藥雜志，2005;35(5):62-4.

9 Barker JM，Barriga KJ，Yu L，et al.Prediction of autoantibody positivity and progression to type 1 diabetes:diabetes autoimmunity study in the young(DAISY)〔J〕.J Clin Endocrinol Metab，2004;89(8):3896-902.

10 Williams AJ，Norcross AJ，Dix RJ，et al.The prevalence of insulin autoantibodies at the onset of type 1 diabetes is higher in males than females during adolescence〔J〕.Diabetologia，2003;46(10):1354-6.

11 Wenzlau JM，Juhl K，Yu L，et al.The cation efflux transporter ZnT8(Slc30A8)is a major autoantigen in human type 1 diabetes〔J〕.Proc Natl Acad Sci U S A，2007;104(43):17040-5.