生物技術在栝樓種質資源研究中的應用概況

王真真， 郭新苗， 辛 杰， 張榮超， 郭慶梅， 周鳳琴

(山東中醫藥大學，山東濟南250355)

來源于栝樓Trichosanthes kirilowii Maxim．的傳統中藥包括全瓜蔞 (果實)、瓜蔞子 (種子)和天花粉 (根)，臨床用于治療多種疾病［1］。隨著栝樓綜合開發應用的領域拓寬［2-6］，栝樓新產區和種植面積不斷增加，對栝樓種質優良性的要求日趨增高［7］。為了獲得優良的中藥種質資源，目前各種生物技術已被廣泛地應用于中藥的種質資源研究，包括分子標記技術［8-10］、生化標記技術［11-12］、細胞學標記技術［13-15］、種苗快繁技術［16-17］等。由于栝樓為雌雄異株、異花授粉植物，有的產區采用葫蘆、絲瓜、南瓜等授粉，使栝樓的種質發生了許多變異，各地瓜蔞生產中存在著種質混亂、種苗良莠不齊的現象，栝樓種質資源的評價以及優良品種的篩選依然是一個困擾瓜蔞優質高產的嚴重問題。本文僅就生物技術在栝樓種質資源研究中的應用進行綜述，為栝樓種質資源研究、優良種質篩選以及優良種苗繁育等提供資料。

1 分子標記技術

分子標記技術在栝樓種質研究中的應用處于起步階段，主要集中在隨機擴增多態性DNA標記 (RAPD)、錨定簡單序列重復區間 (ISSR)、擴增片段長度多態性 (AFLP)等技術的應用。

1.1 RAPD技術在栝樓種質研究中的應用 黃璐琦等［18-19］用RAPD標記法對山東長清瓜蔞農家品種苗期進行了研究，使用CTAB(十六烷基三甲基溴化銨)法提取DNA，擴增結果顯示，該方法能明顯區別瓜蔞的3個主流農家品種;在用該技術對天花粉及類似品進行鑒別的研究中，有效地將26個樣品分成了三大類。王敏等［20］通過對山東仁瓜蔞、糖瓜蔞、牛心瓜蔞進行RAPD標記分析，發現牛心瓜蔞與仁瓜蔞的遺傳距離 (0.478 261)最小，牛心瓜蔞與糖瓜蔞的遺傳距離 (0.846 154)最大，這與生產實踐中瓜蔞質量的表現一致。孫稚穎等［21］采用RAPD標記技術，對瓜蔞各農家品種、野生瓜蔞和山東誤引種的湖北栝樓的親緣關系進行了分析。結果顯示，仁瓜蔞與牛心瓜蔞、小光蛋與野生瓜蔞、大瓜蔞與牛心瓜蔞親緣關系較近，而明皮是形似小光蛋的一個獨立農家栽培品種，地瓜蔞屬于小光蛋的一個較初級的栽培品種，湖北栝樓與其它各農家品種差異顯著。劉亞魯等［22］對馬山同一種植基地的7個性狀特征不同的瓜蔞樣品進行了RAPD分析，結果顯示，7個瓜蔞樣品的遺傳物質之間存在差異，說明在生產實踐中作為同一種種植的瓜蔞仍可能存在瓜蔞種質混亂的危險。曲益濤等［23］應用RAPD和序列特異性擴增區域 (SCAR)分子標記技術成功鑒別未成熟栝樓的性別，以指導生產上合理的雌、雄性植株田間配置以及育種工作［24］。以上實驗說明，栝樓不同品種及品系之間的DNA進化速度、變異范圍和遺傳距離可以通過RAPD標記進行分析，并且取得了與形態學和生產實踐比較一致的結果。

1.2 ISSR技術在栝樓種質研究中的應用 ISSR標記技術能較好的反映物種遺傳結構和遺傳多樣性變化等，擴增特異性、穩定性、重復性較好。曲超等［25］通過單因素試驗和正交試驗，首次建立了栝樓ISSR-PCR分析的最適反應體系:20μL的反應體系中，1×buffer，模板量為50 ng，引物的濃度為0.5μmol/L，Taq DNA聚合酶的用量為0.8 U，dNTPs(三磷酸脫氧核糖核苷)的濃度為200μmol/L。李慧慧等［26］運用正交試驗進行了更細致的體系優化，結果表明，20μL的反應體系中，DNA模板量為30 ng，MgCl2濃度為2.0 mmol/L，dNTPs濃度為0.3 mmol/L，引物濃度為0.5μmol/L，0.5 U Taq DNA聚合酶;退火溫度為52℃ ～55℃;擴增反應程序為:94℃預變性5 min;94℃變性30 s，52℃退火1 min，72℃延伸2 min，35個循環;72℃延伸7 min;4℃保存。高燕會等［27］基于ISSR分子標記法，對采自不同種植地區的34份栝樓種質進行了多態性和聚類分析。通過15條引物進行PCR擴增，共顯示112條帶，其中101條具有多態性，占總擴增帶數的90%。結果顯示，有效的將34份栝樓種質分為3大類群3小組。

1.3 AFLP技術在栝樓種質研究中的應用 千春錄［28］用AFLP分子標記對12份栝樓材料進行實驗，結果顯示二倍體材料 (1、2、3號)為第1組，剩下的八倍體材料為第2組;組內差異分別由組內的明顯分支顯示。孫永剛［29］建立了可以用于栝樓雌雄株鑒別的AFLP反應體系，并篩選出了27對可用于栝樓AFLP分析的多態性引物。由于AFLP標記操作復雜、成本較高［30］，其應用受到局限。

2 生化標記技術

目前，同工酶標記和貯藏蛋白標記在栝樓種質研究中比較常用。

2.1 用于親緣關系的判斷 不同品種、產地栝樓的蛋白電泳圖譜都會出現不同程度的差異［31］。孫稚穎等［32］采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法，對山東栝樓農家栽培品種、野生種以及湖北栝樓的種子蛋白進行了分析。研究表明，山東優質農家品種仁瓜蔞、牛心瓜蔞的種子蛋白電泳譜圖具有明顯的相似性;小光蛋與野生栝樓的蛋白電泳譜圖最相似;湖北栝樓與各山東品種在蛋白電泳圖譜上有明顯差異。這些結果結合性狀特征從蛋白水平上說明:仁瓜蔞和牛心瓜蔞屬于優質品種;小光蛋與野生品種較接近，品質稍差;湖北栝樓與栝樓是同科同屬不同組別的物種。

2.2 用于栽培品種的鑒定 同工酶電泳圖譜譜帶發生多態性變化，反映了生物在蛋白質水平上的多型性，可作為生物遺傳變異的證據［33］。孫稚穎等［34］以過氧化物酶同工酶及酯酶同工酶分析為手段，以山東栝樓的各農家栽培品種以及野生種的幼苗為實驗材料，進行了同工酶電泳分析，結果表明，各農家栽培品種間及與野生種之間的酶帶數量、帶級、位點及活性強度等的差異可作為品種鑒定的依據;根據其同工酶譜圖的相似程度判斷，牛心瓜蔞與仁瓜蔞，野生栝樓與小光蛋，大瓜蔞、八棱瓜蔞及地瓜蔞彼此間親緣關系較近，這與貯藏蛋白電泳圖譜相結合可以更準確的判斷各品種親緣關系的遠近。

2.3 用于雌雄性別的研究 栝樓種植時雌、雄比例對瓜蔞的產量起著關鍵性作用，在雌、雄植株區分方面生物技術優于傳統的鑒別方法。于鳳池等［35］對栝樓雌、雄不同器官進行過氧化物酶同工酶活性和電泳分析，成熟雌株葉片的過氧化物酶同工酶譜帶比雄株多了第5條譜帶 (Rf=0.643);在成熟器官 (葉片、卷須)中，雌株中的過氧化物酶同工酶活性比雄株強，但在幼嫩器官中兩者差別不大。另有研究表明［29］，雌、雄株的葉片、葉柄、卷須、莖尖的各種同工酶圖譜均存在不同程度差異。過氧化物酶同工酶圖譜分析:葉柄的圖譜中出現了4條相關譜帶;多酚氧化酶同工酶分析:幼苗葉柄、莖尖圖譜中雄株各出現1條特征譜帶，卷須、葉片、莖尖圖譜中雌株各出現1條特征譜帶。雌雄株的酯酶同工酶圖譜、雌雄株不同部位的同工酶含量也表現出一定的差異性。

3 細胞學標記技術

細胞學標記技術主要是指染色體核型和帶型分析，是細胞遺傳學研究的基本方法。

3.1 用于物種的鑒定 根據傳統的理念，栝樓染色體的核型對稱性、隨體大小和數目等方面的差異可以作為分析栝樓不同基因型材料的親緣關系及種質鑒定的方法。黃璐琦等［36］對國內栝樓屬的8個物種進行了形態學觀察和鑒定，發現了中藥瓜蔞和天花粉的染色體特點為表現為八倍體，二倍體一般不能入藥或甚至有毒副作用;并且，多倍體與器官特化以及地理分布尚未發現有規律的聯系。

3.2 用于染色體倍數與次生代謝物質相關性研究 楊福紅等［37］研究了人工誘變不同倍性染色體栝樓的生長發育及果實糖、酸含有量變化，結果表明四倍體栝樓的長勢、葉片中含葉綠素量、果實中含總糖和總酸的量明顯優于二倍體;四倍體栝樓果實大小、質量、結實率和百粒重明顯小于二倍體，差異極顯著。黃秋波等［38］以五個不同產地的9種栝樓品系為實驗材料研究了染色體倍性與物質積累之間的關系，9個品系中一類是染色體數目為2，n=6X=66的六倍體，另一類是染色體數目為2，n=8X=88的八倍體。八倍體栝樓在整個生長發育時期其葉片可溶性糖含量均高于六倍體，在盛花期時的差異達顯著水平;二者葉片可溶性蛋白含有量無明顯差異，總體來看，以盛花期為限，之前，六倍體栝樓葉片可溶性蛋白質含有量高于八倍體，之后，八倍體栝樓葉片中可溶性蛋白質含有量相對更高;八倍體栝樓葉片含葉綠素量都低于六倍體，不同發育時期的相對差異幅度為4%～10%。這為栝樓優良品種的培育和多倍體育種提供了指導依據。

4 種苗快繁技術

4.1 外植體選擇研究 在已有的關于栝樓試管苗快速繁殖體系［39］和外植體取材研究［40］的基礎上，楊曉伶等［41］以栝樓莖段、葉片、塊莖幼苗的莖尖和帶芽莖段進行了快繁外植體選擇研究。結果表明，MS培養基+2 mg/L芐氨基腺嘌呤 (BA)+0.5～0.05 mg/Lα-萘乙酸 (NAA)可誘導塊莖幼苗莖尖及帶芽莖段產生叢生芽，在MS培養基+0.1 mg/L NAA+0.2 mg/L吲哚丁酸 (BA)作用下生根，能夠在移栽后實現快速繁殖，而莖段和葉片可形成愈傷組織，但不能形成根。

4.2 最佳快繁條件研究 余慧琳等［42］通過對莖段腋芽的離體快繁研究，確定了形成無菌試管苗的最佳培養基為MS培養基+0.2～0.3 mg/L BA+0.1～0.2 mg/L NAA組合;繼代增殖最佳培養基為MS培養基+0.1 mg/L BA+0.1～0.2 mg/L NAA組合;生根最佳培養基為1/2 MS培養基+0.2 mg/L NAA組合。陳惠［43］研究發現將不定根根尖，接種在MS+4 mg/L BA的培養基上光下培養效果最佳。蘭偉等［44］研究并確定了適宜栝樓芽及愈傷組織誘導、繁殖、生根的最佳培養基條件。有研究［45］對不同激素對栝樓試管苗生根影響進行了研究，6-芐氨基腺嘌呤 (6-BA)為1.5 mg時對芽的誘導效果最好;采用MS培養基附加1.0 mg/L 6-BA+0.3 mg/L IBA+0.05 mg/L NAA增殖效果好;IBA比NAA更能促進生根。各種最佳條件的確立對于栝樓優質種苗選育、大規模細胞培養以提取有效成分的研究有著重要意義。

4.3 其它 近年對栝樓細胞培養、雌雄株組織培養和發根農桿菌誘導的研究也有報道［46］，建立起了分散程度較好的栝樓懸浮細胞系，發現了雌雄栝樓愈傷組織的分化具有性別差異，培養基也有所不同。寧志怨［47］、丁婷等［48］分別對發根農桿菌誘導栝樓組培苗莖段和葉片生根、無菌苗毛狀根發生進行了實驗，發現該種方法可以成功地整合基因，后者發現LBA9402農桿菌對毛狀根的產生誘導率最高，并且毛狀根不定芽最佳分化培養基為 (6-芐基氨基嘌呤)2.0 mg/L 6-BA+2.0 mg/L激動素+0.5 mg/L NAA。

5 小結與展望

5.1 分子標記技術 由于分子標記技術在栝樓種質資源研究中的應用缺乏任何分子生物學的研究背景，在研究過程中，要得到具有統計意義的結果，必須選擇多達幾十條，甚至上百條隨機引物。實驗過程中，PCR這一步驟受到退火溫度等諸多因素的影響，所以各種分子標記技術的穩定性和可重復性尚有待深入研究。另外，ISSR標記在栝樓種質研究中的應用研究不夠深入，并且各種技術之間缺乏一定的相互印證。但不可否認，分子標記技術在目前栝樓DNA序列尚未清楚的情況下，有著廣闊的應用前景;隨著該技術與經典形態學相結合在栝樓種質研究中的深入應用，可以考慮從堿基水平上進行研究，探索DNA序列差異與有效物質之間的關系，不僅使種質差異更加具體化，而且可以更加具體的指導良種選育和大規模細胞培養。

5.2 生化標記技術 生化標記技術用于不同品種栝樓的區分，但產地、生長年限、部位和性別的不同都會使譜圖產生差異。今后在種質區分研究中可以考慮同時運用多種技術，相互印證，獲得更為穩定的結果;而在栝樓遺傳結構和遺傳多樣性變化的研究中就要考慮到產地、年限、部位、性別的因素，適時應用。比如，Lata等［49］已將ISSR技術用于微體繁殖植株的遺傳穩定性研究，可以將該技術用于栝樓優良種質快繁植株的基因穩定性研究，以確保種質研究的有效性。

5.3 細胞學標記技術 目前已將栝樓染色體核型分析應用于物種進化分析［15］和染色體核型與果實中糖酸積累、植株生長發育相共性的研究，對優良品種的選育發揮了重要作用。染色體作為遺傳物質的載體，具有指導合成生物體內各種蛋白質、核酸等的遺傳信息，因此，與生物體內次生代謝產物的形成和積累有著必然的聯系。細胞學標記技術與次生代謝產物相關性的研究，對于栝樓優良種質選育和大規模規范化種植及細胞培養有著重要的指導意義。所以，對于栝樓有效物質的積累與遺傳物質的關系的研究將會越來越受到大家的重視。

5.4 種苗快繁技術 栝樓是雌、雄異株植物，種子繁殖極易發生變異，且雌雄難辨;用分根法繁殖系數低，使發展良種生產受到一定限制。利用組織培養法進行種苗快繁，具有繁殖系數高、速度快、成苗率高等優點，可作為栝樓良種快速繁殖的有效途徑。人們已經對外植體、最佳培養基、激素、細胞培養、發根農桿菌誘導毛狀根發生等方面進行了研究，建立了多個快繁體系。為了理順栝樓優質種苗渠道，尚需將快繁技術規范化和規模化，才能使現代生物技術應用于生產實踐中。

5.5 展望 栝樓種質資源研究中尚普遍存在著樣品的有限性問題，需要全面收集全國的栝樓種質;針對栝樓種質豐富、良莠不齊的現狀，可以先通過分子標記技術 (主要是ISSR標記技術)進行遺傳結構和親緣關系的研究，進而結合生化標記技術和經典形態學研究進行細致的品種劃分。在此基礎上，再進行有效物質和快速繁殖的研究。運用生物技術對栝樓進行種質研究，順應了從分子水平上對中藥材進行質量控制的趨勢，將對栝樓的質量控制、活性成分研究產生不可估量的作用。

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