煙草基因組計劃進展篇：5.栽培煙草主要推廣品種基因組差異分析

任學良

（煙草行業分子遺傳重點實驗室，貴州省煙草科學研究院，貴陽 550081）

優良推廣品種的利用價值取決于其攜帶的優異基因，通過基因組差異研究可提供這些優異基因最基本的遺傳信息，有助于加快其研究、利用。為此，在中國煙草總公司和貴州省局（公司）的資助下，由貴州省煙草科學研究院牽頭，聯合行業內外多個單位實施的煙草主要品種和核心種質資源基因組差異研究工作，對100年來中國和美國育成的具有明確系譜關系的主要栽培品種進行了基因組測序，圍繞基因組結構變異揭示育種目標這一核心主題，取得了顯著進展。

1 開發出一批高質量SNP和Indel位點

基于Hiseq2000測序平臺，對42份煙草主要栽培品種進行了基因組測序，質量控制和序列過濾后，總共獲得了4853.7 Gb的高質量數據，平均每份材料133.4 G，平均覆蓋29.1倍，GC含量在37%～39%。K-mer分析表明，42份栽培品種基因組的平均大小為4.30 Gb。

以BWA軟件為序列比對工具，把42份材料的429億條序列定位到參考序列紅花大金元基因組上，占總序列數的96.17%，平均每份材料約11.6億條。以samtools為檢測工具，總計在42份材料中檢測到6,429,601個SNP和831,597個Indel位點。進一步過濾后，分別獲得3,334,065和297,781個高質量SNP（單核苷酸多態性）和Indel（插入缺失）位點。以參考序列大小為4.5 Gb計，栽培煙草SNP和Indel的基因組密度分別在0.074%～0.143%和0.0066%～0.0185%，低于番茄的SNP密度(0.194%-0.265%）[1]。這些SNP的鑒定，為繪制煙草高密度遺傳圖譜和開發煙草高密度SNP芯片提供了基礎。

對SNP和Indel的位點注釋發現，有150,076個SNP/Indel落在19,874個基因內，占檢測總SNP/Indel的2.3%。Ka/Ks（非同義SNP數與同義SNP數的比值）為1.6，表明遺傳群體基因受到強烈正選擇。

2 繪制了煙屬物種第一張單倍體型草圖

基于發現的高質量SNP位點，利用Haploview分析軟件，繪制了含有26,727個單倍型塊、覆蓋基因組46.6%的栽培煙草單倍體型草圖，初步統計測序材料的LD（連鎖不平衡）值超過1 Mb。通過檢測到的Tag SNPs（標簽單核苷酸多態性），結合LD值表明，栽培煙草覆蓋整個基因組的遺傳圖譜或關聯分析至少需要8萬個SNP標記。煙草單倍型草圖與即將完成的栽培煙草序列圖一起，使栽培煙草的基因組研究在總體框架上接近水稻、玉米等主要農作物的水平，為高效開展煙草分子育種奠定了堅實基礎。

3 發現了高度影響煙草遺傳多樣性的基因組區段

PAC（主成分）和NJ（鄰接法）系統樹分析將測序的42份材料分為兩組，任意測序材料基因組間的SNP數目范圍在153,344和1,820,841之間，平均為889,300。測序材料的π值（序列多樣性)為0.00015，遠小于秈稻（0.0016）和粳稻（0.0006）[2]。

雖然測序材料的遺傳多樣性總體上比較低，但序列多樣性在基因組上分布不均勻，存在遺傳多樣性非常高的區段。以總體序列多樣性估計值的10倍，0.0015為閾值，總共找到879個高變異區段，這879個高變異區段屬于93個scaffolds，雖然大小只有190 Mb，卻包含了100多萬個SNP位點，解釋了約66%的群體遺傳多樣性，表明這些區段對于煙草育種具有極端重要性。

4 確定了1604個育種選擇重要基因

群體的FST（總體差異水平）值估計為0.118，在p=0.05水平下，通過FST檢驗一共找到1635個表現出群體差異的區段，包含了4098個預測基因，其中有3659個來自上述的93個scaffolds（占總發現基因的64.1%）。這些基因中1604個存在有義等位突變，其中約400個與物質代謝相關，350個與逆境、病蟲害抗性相關，深入研究和不斷選擇這些基因對煙草育種具有重要意義。

5 追溯了栽培煙草基因組依系譜關系的選擇歷程

利用檢測的334萬個高質量SNP標記，采用IDB（來源同一）法，分析了從最早的Orinoco品種到最近的云煙97具有系譜關系的6代品種近百年育種進程中基因組發生的變化。研究發現，育成品種基因組的親本來源比例各代分別為39.87%、23.07%、20.43%、9.80%、9.37%和4.80%。除前兩代外，其他代基因組親本來源的平均比例都高于理論值（理論比例分別為50.00%、25.00%、12.50%、6.25%、3.13%和1.56%）。此外，分析發現，子代約8.5%的基因組為非雙親基因組，從基因組水平揭示了雜交重組創造變異的深刻機制。這些是基于煙草結構基因組研究取得的重要科學發現，將為通過分子育種手段選擇優良品種提供理論支持。

[1]Shirasawa K, Fukuoka H, Matsunaga H, et al.Genome-wide association studies using single nucleotide polymorphism markers developed by re-sequencing of the genomes of cultivated tomato[J].DNA Res, 2013, dst033v1-dst033.

[2]Huang X, Kurata N, Wei X, et al.A map of rice genome variation reveals the origin of cultivated rice[J].Nature, 2012, 490:497-501.