缺血后處理對缺血再灌注后海馬CA1區神經元蛋白酶體活性的影響

楊 穎 王光明 徐 寧 葛鵬飛 羅毅男 (吉林大學第一醫院神經外科，吉林 長春 130021)

缺血后處理對缺血再灌注后海馬CA1區神經元蛋白酶體活性的影響

楊 穎 王光明 徐 寧 葛鵬飛 羅毅男 (吉林大學第一醫院神經外科，吉林 長春 130021)

目的探討缺血后處理對短暫腦缺血后海馬CA1區神經元內蛋白酶體活性及氧化性蛋白質損傷的影響。方法采用大鼠全腦缺血模型。Wistar大鼠分為缺血組及缺血后處理組，每組按照再灌注時間進一步分為12 h恢復組，24 h恢復組，48 h恢復組及72 h恢復組。缺血后處理為在腦缺血結束后給予三個循環的30 s缺血和30 s再灌注處理。采用HE染色光鏡觀察腦缺血后神經元死亡;用Succinyl-LLVY-AMC作為底物檢測蛋白酶體的活性變化;差速離心結合蛋白印跡分析蛋白酶體相關蛋白的表達。結果HE染色顯示缺血后處理顯著降低了腦缺血再灌注后海馬CA1區神經元死亡;酶活性檢測，缺血后處理使得蛋白酶體的活性顯著提高;蛋白印跡分析顯示，缺血后處理顯著提高了蛋白酶表達。結論缺血后處理能夠顯著改善腦缺血后海馬CA1區神經元內蛋白酶體的活性，降低了缺血再灌注后海馬CA1區神經元死亡。

缺血后處理;腦缺血再灌注;蛋白伴侶hsp70;蛋白伴侶hsp40

缺血后處理是指在腦缺血結束后，反復地間斷性阻斷腦血流的恢復，進而達到腦保護的目的〔1〕。近年研究發現，缺血后處理(Ischemic postconditioning)對腦缺血再灌注所致的神經元延遲性死亡的保護作用與其能夠降低氧化應激反應、激活細胞內的信號傳導途徑有關〔2，3〕，但是其對腦缺血再灌注過程中蛋白酶體的影響尚不清楚。以往研究顯示，在腦缺血再灌注過程中蛋白酶體的活性顯著下降〔4〕，這被認為是導致腦缺血再灌注后神經元內形成蛋白聚集物的重要病理基礎之一〔5〕。因此本研究中，采用大鼠全腦缺血模型，探討了缺血后處理對海馬CA1區神經元內蛋白酶體的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 雄性Wistar大鼠，280～320 g，80只，吉林大學實驗動物部提供。分為腦缺血組，后處理組;每組又分為假手術組，12 h恢復組，24 h恢復組，48 h恢復組及72 h恢復組。每組8只，其中4只用于蛋白印跡分析，4只用于蘇木素-伊紅(HE)染色。

1.2 實驗試劑及設備 抗熱休克蛋白(hsp)70及hsp40多克隆抗體(美國Cell signaling公司)。蛋白質濃度測定試劑盒(美國Bio-rad公司)。增強化學發光(ECL)試劑(美國Amersham公司)，其他試劑均購自美國Sigma公司。聚偏氟乙烯(PVDF)膜(美國Millipore公司)，膠片(美國Kodak公司)。電泳槽及電泳儀購自美國Bio-Rad公司。激光掃描共聚焦顯微鏡為德國產Zeiss LSM 510型;震動切片機為德國產Leica VT-1000S型。

1.3 方法

1.3.1 全腦缺血模型的制作 全腦缺血模型的制作采用雙側頸總動脈暫時夾閉法。動物禁食12 h，隨意飲水。先以5%(30%O2，70%N2O)氟烷誘導麻醉，然后以2%濃度維持麻醉。尾動脈插管監測動脈血壓，同時注射0.05 ml(150 IU/kg)肝素。右側股動脈插管備用。頸部正中直切口，分離雙側頸總動脈。顳肌下和直腸內分別插入熱敏探頭，監測頭溫和體溫;手術過程中用恒溫毯將頭溫和體溫保持在36.8℃ ～37.2℃。缺血時先用動脈瘤夾夾閉雙側頸總動脈，經股動脈抽血將動脈壓降至50 mmHg后再進行缺血，缺血時間為15 min。缺血結束后，除去動脈瘤夾并將血液回輸。

1.3.2 缺血后處理方法 腦缺血結束后，松開動脈瘤夾恢復腦供血30 s，再夾閉雙側頸總動脈阻斷腦供血30 s;如此反復，3個循環后完全解除頸動脈夾閉，徹底恢復腦供血。見圖1。

1.3.3 腦組織固定 將大鼠麻醉、氣管插管后連接呼吸機，以3%的氟烷維持麻醉，打開胸腔，暴露心臟，左心室內注射0.1 ml(300 IU/kg)肝素后，將導管經左心室插入主動脈，先以4℃的PBS液沖洗3 min，然后用4℃含有4%多聚甲醛的磷酸鹽緩沖液(PBS)液灌注3 min，取出腦組織，放于含有4%多聚甲醛的PBS液中固定24 h(4℃)。

1.3.4 HE染色 將載有腦片的載玻片放置于背光處陰干，用梯度乙醇溶液脫水后置于HE溶液中15 s，沖洗干凈后，放入Scott溶液中10 s，沖洗后放入HE溶液中10 s，再經乙醇溶液脫水后進行透明處理，加蓋玻片。在高倍顯微鏡下選擇海馬CA1區進行觀察，同時對存活的神經元進行計數。

1.3.5 胞漿蛋白組分的分離 大鼠麻醉后，迅速斷頭，分離海馬CA1區腦組織用液氮冷凍保存。將腦組織稱重后，按照重量體積比1:10加入勻漿緩沖液，勻漿器抽壓35次。勻漿組織液以4℃ 6 500 r/min離心20min，抽取上清用于分離胞漿蛋白組分(分離條件為4℃ 75 000 r/min離心1 h，上清即為含有胞漿蛋白的組分)。Bradford法測定含有胞漿蛋白組分的蛋白濃度后，保存于－20℃冰箱備用。

1.3.6 蛋白印跡分析 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳。0.45μm PVDF膜濕法電轉膜。室溫下3%胎牛血清(BSA)封閉1 h。置于搖床上與抗蛋白酶體anti-20Sα-1(1∶1 000)，anti-19SS12(1∶1000)在 4℃下孵育過夜。室溫下與二抗孵育1 h。再與ECL一起孵育1 min，然后經過曝光，顯影，沖洗，定影等步驟。將沖洗后的膠片掃描到電腦中，用Kodak 1D軟件測定每一個條帶的灰度值。

1.3.7 蛋白酶體活性檢測 將10μl(1μg/μl)新鮮制備的海馬CA1區勻漿混合物至于96孔板內，在37°C與10μl的succinyl-LLVY-AMC(300μmol/L)以及 85μl的分析緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5，and 20%glycerol)共同孵育30 min，分光光度計檢測結果。

1.4 統計學方法 應用STATA2.0統計軟件進行分析，所有數據以±s表示，組間比較采用單因素方差分析。

2 結果

2.1 缺血后處理具有保護短暫腦缺血后神經元延遲性死亡的作用 HE染色顯示缺血再灌注后72h，海馬CA1區神經元幾乎全部死亡，死亡的神經元胞漿粉染，胞核固縮深染，呈現多角形。然而缺血后處理組則有部分神經元存活。統計發現，缺血組僅有5.21%±1.21%的神經元存活;而后處理組存活的神經元則高達55.32%±5.34%，二者之間具有顯著性差異(P＜0.01)。這提示，缺血后處理對腦缺血后海馬CA1區神經元具有保護作用。

2.2 缺血后處理能夠顯著改善海馬CA1區神經元內蛋白酶體的活性 蛋白酶體活性檢查結果顯示，同假手術組相比較，在腦缺血再灌注后12 h，24 h和48 h海馬CA1區內蛋白酶體的活性分別降低到45.32% ±4.13%，47.41% ±3.83%和43.52%±4.22%。然而，缺血后處理使海馬CA1區神經元內的蛋白酶體活性分別提高到73.63% ±6.61%，79.23% ±7.14%和77.63%±5.92%。

2.3 缺血后處理能夠顯著提高海馬CA1區神經元蛋白酶體的表達 蛋白印跡分析顯示，在缺血組中海馬CA1區神經元內蛋白酶體20Sα-1和19SS12亞基的表達在再灌注后12 h，24 h和48 h呈顯著降低;但是，缺血后處理能夠改善了海馬CA1區神經元內20Sα-1和19SS12亞基的表達。統計分析顯示，二組之間具有顯著性差異。

3 討論

對于蛋白聚集物形成的機制，目前較普遍的觀點是，細胞受到應激刺激后，一方面細胞內新合成的蛋白質會產生錯誤折疊(misfolded);另一方面，細胞內的蛋白質會發生解鏈(unfolded)而變性〔6，7〕。這兩類異常蛋白質都不具有正常的空間結構，使本應該位于蛋白質內部的疏水集團暴露在外面，這些具有黏性的疏水基團彼此粘連在一起形成細胞毒作用的蛋白聚集物〔8〕。蛋白聚集物可以沉積在胞漿中，也可以黏附在線粒體和高爾基體等膜性細胞器上，影響細胞的正常生命活動，最終導致細胞的死亡〔9〕。

細胞內每時每刻都有錯誤折疊蛋白及解鏈蛋白生成，但細胞內并不形成蛋白聚集物，這是因為細胞內存在蛋白質量控制(Protein quality control)系統，能夠監控細胞內形成的異常蛋白，并及時地將其清除掉〔10〕。蛋白酶體是真核細胞內存在的選擇性降解損傷蛋白、錯誤折疊蛋白及解鏈蛋白的降解途徑，是細胞內蛋白質質量監控系統的重要組成部分。以往研究表明，全腦缺血再灌注后，蛋白酶體活性顯著下降，這被認為是導致細胞內需要降解的蛋白不能被及時分解，進而這些不具有正常結構的蛋白質彼此粘連在一起形成具有細胞毒作用的蛋白聚集物〔11〕。而且，這些暴露了黏性疏水末端的異常蛋白還可以粘連到細胞內的膜性結構上，導致細胞內的膜性結構功能障礙，不能執行正常的生物功能。因此，改善蛋白酶體的活性能夠促進細胞內異常蛋白的降解，減少細胞內的蛋白聚集物的形成。但是，目前尚缺乏有細胞的途徑提高腦缺血蛋白酶體的活性。

本研究進一步證實了蛋白酶體活性下降與腦缺血再灌注后神經元死亡有密切關系，還為缺血后處理的腦保護作用提供了一個新的途徑。

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11 Ge P，Luo Y，Liu C，et al.Protein aggregation and proteasome dysfunction after brain ischemia〔J〕.Stroke，2007;38(13):3230-6.

R749

A

1005-9202(2013)05-1064-02;

10.3969/j.issn.1005-9202.2013.05.036

國家自然科學基金資助項(No.30973110);吉林省科技廳(No.200805122)

羅毅男(1951-)，男，教授，主任醫師，博士生導師，主要從事缺血性腦損傷及腦腫瘤的臨床研究。

楊 穎(1984-)，女，在讀碩士，主要從事缺血性腦損傷的臨床研究。

〔2012-11-12收稿 2013-01-10修回〕

(編輯 袁左鳴)