FOXA1的作用機制及作為乳腺癌預后生物標志的研究進展

盧 微 劉雅文 程 熠 (吉林大學白求恩第一醫院心血管疾病診治中心，吉林 長春 30000)

乳腺癌的發病具有明顯的家族遺傳傾向，而且與自身的雌激素水平密切相關。雌激素作用于雌激素受體(ER)從而調控的基因表達，是乳腺癌研究的重點。老年人由于雌激素分泌水平的改變以及其他機體功能的減退，是乳腺癌的高發人群。在發達國家，50%以上的乳腺癌患者是65歲以上的老年婦女〔1〕。叉頭盒蛋白A1(FOXA1)是叉頭盒蛋白家族成員之一，既有ERα輔助激活因子的功能，又有輔助阻遏因子的功能〔2～4〕，在乳腺、肝臟、胰腺、膀胱、前列腺、結腸和肺中均有表達，與包括乳腺癌在內的許多癌癥的發病機制密切相關〔5～8〕。本文綜述了FOXA1的作用機制及其作為乳腺癌預后生物標志的研究進展。

1 FOXA1的基因表達、結構和作用機制

1.1 FOXA1的基因結構與表達 人FOXA1是一個472個氨基酸殘基組成的轉錄輔助因子，可與含A(A/T)TRTT(G/T)RYTY序列的蛋白結合。FOXA1編碼基因位于14q21.1，其轉錄區域橫跨5 400個堿基，包括兩個外顯子和一個內含子。在乳腺癌組織中，FOXA1編碼基因擴增，但未發現該基因存在轉位和缺失。

激素是FOXA1轉錄的調控因素。在乳腺癌細胞中，胰島素可以抑制FOXA1的表達，而雌激素能夠誘導其表達。此外，FOXA1表達也受到其他轉錄因子的調節，Oct-4(octamer-binding transcription factor 4)和SOX4(SRY-related HMG-box transcription factor 4)對FOXA1表達起阻遏作用，而SOX17(SRY-related HMG-box transcription factor 17)和GATA-3(Transacting T-cell-specific transcription factor)增強 FOXA1 的表達〔4〕。此外，PPARγ(Peroxisome proliferator activated receptor gamma)可以上調FOXA1的表達。

1.2 FOXA1的蛋白結構與轉位調控 FOXA1蛋白序列從N端至C端分為反式激活結構域(1～93)，未知功能區(94～167)，叉頭盒結構域(169～268)，未知功能區(269～416)和反式激活結構域(417～472)。核定位信號肽位于叉頭盒結構域的N端。FOXA1反式激活結構域(位于第1-93個氨基酸殘基)的N端有一個酪蛋白激酶1的磷酸化位點〔9，10〕。

FOXA1的叉頭盒結構域(FHD)由110個氨基酸殘基組成，序列高度保守，FOXA1通過FHD與DNA結合。FHD呈現出具有側翼的螺旋-環-螺旋構象。FHD包括三個主要的α螺旋和三個反向平行的β折疊，其中第三個α螺旋與DNA主要的大溝相結合，是主要的DNA識別結構域。三個依次排列的α螺旋通過β折疊形成兩個可以環繞DNA分子的環狀結構，以穩定蛋白和DNA的相互作用。FOXA1可被p300乙酰化，通過計算機模擬分析發現:FHD有11個乙酰化位點，分別位于第6、160、163、237、240、264、267、270、385、410、414 個氨基酸殘基〔11〕。FOXA1主要位于細胞核。轉化生長因子 β1(TGF-β1)處理會導致FOXA1轉位至胞漿，這一過程可能需要蛋白激酶C(PKC)的參與。

1.3 FOXA1與染色質的相互作用 FOXA1解開壓縮的染色質需要組蛋白H3/H4的參與，染色質構象張開有助于其他轉錄因子的結合〔12～14〕。構成FoxA1 FHD的一個螺旋與組蛋白H1和H5的側翼螺旋結構域相似，該螺旋可能通過占領組蛋白H1和H5的DNA結合位點，起到與DNA和組蛋白核心結合的連接子作用〔9，15，16〕。

基因組中低甲基化的DNA區域易與FOXA1結合。DNA的去甲基化是FOXA1表達及其隨后被募集到靶基因增強子的基礎，而FOXA1的募集又進一步誘導在這些增強子區域的組蛋白H3的第4個賴氨酸殘基的甲基化〔8〕。這些表觀遺傳的改變穩定FOXA1的結合，并隨后促進其他轉錄調節因子(SRC-3，USF2，TLE3，COUP-TFII，SHP，SMAD3 和 HDAC7)的 募集〔8，17，18〕。

2 FOXA1在乳腺癌細胞中的作用機制

FOXA1對乳腺腫瘤表型起重要作用。全基因表達的研究結果表明，在ER-α表達陽性和陰性的乳腺癌細胞中，FOXA1表達水平較高〔19，20〕。乳腺中的FOXA1缺失可造成導管形態學損傷，影響在ER陽性腺腔型上皮細胞雌激素受體的數量。FOXA1與ER-α、GATA3等輔助因子的相互作用，以及FOXA1對細胞周期的調節作用，是目前研究得相對清晰的FoxA1作用機制。

2.1 FOXA1與ER-α的相互作用機制 在乳腺癌腫瘤及細胞系中，FOXA1的表達與ER相互關聯。FOXA1是影響ER與染色質相互作用的決定性因素。

在人類21和22號染色體上的ER結合位點約有57個，這些位點大多含有叉頭模體和ERE序列或半ERE序列。ER和FOXA1的募集區域高度統一，約有48%的雌激素結合位點有FOXA1的相互作用。此外，有些不含叉頭模體的ER結合位點也募集 FOXA1，這種機制尚不清楚〔20～22〕。

FOXA1作為先導因子促進后續的連接反應，這不僅促進了其他蛋白質與之聯系，還優化了常染色質的狀態。研究發現:ER結合位點和FOXA1結合位點之間的重疊區在同一種乳腺癌細胞系中達到了52%～58%，這些重疊區域大多處在有完整核小體聚縮的染色質部位，而二者的非重疊區域處在無核小體結構的松弛染色質區域。FOXA1的結合引起DNase I對結合位點切割活性的提高，與目的基因轉錄上調關系密切。在缺少FOXA1的MCF-7乳腺癌細胞系中，雌激素依賴性基因轉錄相應減弱〔23〕;FOXA1表達水平的降低可完全阻礙ER與TFF-1啟動子、XBP-1增強子1和NRIP-1增強子的結合能力。FOXA1的存在可確定染色質上的特異性的位點，從而有利于ER轉錄復合物的結合〔20〕。

此外，TLE1介導ER與染色質作用也受到FOXA1的調控。FOXA1位于TLE1的上游，是TLE1表達的必要條件。FOXA1蛋白表達水平的降低可使TLE1表達水平下調，從而在非FOXA1結合的基因組區域，影響ER-染色質的相互作用〔24〕。

除了調控ER的活性，研究發現FOXA1可直接結合在ESR1啟動子上，ESR1是ER mRNA在乳腺癌中表達所必需的。因此，FOXA1除了可對ER的活性進行調控，也可對乳腺癌中ER的表達水平進行調控。

2.2 FOXA1和GATA3在乳腺癌細胞中的相互作用 GATA3結合在編碼FOXA1的基因調控區，FOXA1在乳腺中的表達與GATA3高度相關〔25〕。在乳腺癌中，GATA3在腺腔上皮細胞的分化和分化上皮細胞的導管樹的形成中起重要作用。GATA3的表達與乳腺癌中ER的表達水平關系密切。研究證明:77% ～95%的ERα陽性細胞GATA3陽性，0% ～24%ERα陰性細胞表現GATA3陽性〔26〕。在ER陽性乳腺癌細胞中，GATA3高水平表達并和FOXA1共同募集在細胞型專一性增強子。GATA3在ER的上游區域發揮作用，與ERE的啟動子相互作用從而調節其轉錄，并參與ER和其他核因子如FOXA1的對話。

2.3 FOXA1與細胞周期的關系 FOXA1與許多參與細胞周期調控的關鍵因子關系密切，可直接或間接影響其表達，從而對細胞周期的進行和抑制進行調控。

FOXA1是GATA3下游效應因子，可作為連接GATA3和ER信號轉導途徑的樞紐，控制并調節腺腔型乳腺癌的發展〔4〕。GATA3在維持分化細胞靜息狀態中起重要作用，GATA3表達的缺失可引起G1期停滯和細胞增殖降低〔3〕。

乳腺癌細胞中FOXA1的過量表達也可影響與細胞周期相關的抑制因子BRCA1和p27的表達，并且促進E鈣黏著蛋白(E-cadherin)的表達〔4〕。實驗證明:FOXA1在 luminal(MCF7 and SKBR3)型和basal(MDA-MB-231)型乳腺癌細胞系中可轉錄激活并強迫表達細胞周期抑制因子p27等，降低癌細胞的數量〔27〕。E-cadherin基因表達的缺失可導致細胞與細胞之間黏附功能障礙，引發癌細胞的浸潤和轉移。人類E-cadherin調控基因上有4個FOXA1結合位點，在乳腺癌細胞中FOXA1通過激活E-cadherin啟動子，調節細胞周期的進行〔2〕。研究發現，抑制FOXA1在MCF-7乳腺癌細胞中的表達可以阻礙ER與TFF1的啟動子的作用，阻礙雌激素對TFF1的誘導表達，從而阻止激素誘導下重新進入細胞周期，而正常表達FOXA1蛋白的乳腺癌細胞會脫離靜止狀態，進入細胞周期過程〔3〕。RPRM是一種細胞周期抑制子，RPRM的表達可明顯阻遏細胞周期的進行。siRNA抑制RPRM的表達可導致進入S期的細胞明顯增加。全基因測序結果表明:RPRM序列上存在多個ERE位點和FOX結合位點。RPRM的抑制作用受ER的介導，FOXA1可募集到RPRM啟動子上，導致RNA PolⅡ從RPRM啟動子上分離，從而使轉錄效率降低。在MCF7細胞中，抑制FoxA1的表達，可導致E2介導的RPRM的表達抑制缺失〔28〕。

3 FOXA1與乳腺癌預后的關系

FOXA1是介導ER行使其功能的輔因子。FOXA1的表達與ER陽性腺腔型乳腺癌的分型有潛在的關聯，以核著色的百分數對FOXA1的表達進行打分(3分以上是陽性)，結果發現184例樣本中有139例為ER陽性〔5〕。全基因組表達研究也表明:FOXA1 mRNA的高表達與預后良好的ER陽性乳腺癌細胞相關;在Luminal亞型中，A型預后好于B型。FOXA1可作為Luminal A 亞型的預后標志物〔29～33〕。

ER、孕激素受體(PR)和HER2/neu是重要的診斷及預后標志物，研究〔23〕發現:對404個乳腺癌患者的乳腺癌組織進行取樣分析，其中300個患者的FOXA1陽性表達，且FOXA1的表達與ER-α陽性、PR陽性、Luminal A亞型呈正相關，組織惡化的乳腺癌細胞中FOXA1表達降低;FOXA1在純粹的原位導管癌中的表達水平明顯高于在浸潤導管癌中的表達水平。通過對FOXA1表達水平有明顯差異的IDC樣本之間進行比較，發現FOXA1的表達與良好預后指標如低腫瘤分級、淋巴血管浸潤率降低、ER表達呈正相關，而與EGFR、CK5/6，CK14 and CK17 呈負相關〔4、5、27〕。

盡管FOXA1的高表達與更好的生存率相關，但多元分析顯示FOXA1并不是一個獨立的預后因素，單獨的FOXA1免疫組化評估結果并不可用于臨床上區分luminal有顯著差異的亞型〔4、5〕。GATA-3水平是一個臨床乳腺癌分析的高敏感預后指標〔26〕，在FOXA1陽性表達的乳腺癌細胞中，83.1%為luminal A型，GATA-3陽性表達的乳腺癌細胞中，87.7%為luminal A型，二者存在高度的一致性。

4 結語

ER陽性的乳腺癌患者對內分泌治療的反應敏感。早期診斷及預后的判斷對老年乳腺癌患者具有重要意義。FOXA1介導ER調控的基因轉錄，其表達水平可標志良好的預后效果。由此可知，FOXA1是一種與乳腺癌細胞生長與凋亡密切相關的蛋白因子。深入研究FOXA1在乳腺癌細胞中的分子調控機制，有助于老年乳腺癌的診斷和治療。

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