再生障礙性貧血小鼠造模方法

邢海燕 胡春萍 蔡雪婷 胡燦紅 曹 鵬 王志剛 (江蘇省中醫藥研究院，江蘇 南京 210028)

再生障礙性貧血小鼠造模方法

邢海燕 胡春萍 蔡雪婷 胡燦紅 曹 鵬 王志剛 (江蘇省中醫藥研究院，江蘇 南京 210028)

目的 探討再生障礙性貧血(AA)小鼠造模方法。方法 三次造模分別采用:免疫介導法:小鼠經6.0 Gy60Coγ射線亞致死量全身照射后，由尾靜脈輸入DBA/2小鼠的胸腺、淋巴結混合細胞懸液1×106個細胞/0.2 ml/只。混合方法:小鼠一次全身3.0 Gy60Coγ射線照射后，分別在第4、5、6天腹腔注射環磷酰胺50.0 mg/kg及氯霉素62.5 mg/kg。化學方法:用苯+玉米油，背部皮下注射，3次/w，共注射15次。同時腹腔注射環磷酰胺溶液(50 mg/kg)，每日1次共7次。結果 免疫介導法造模后模型小鼠在15 d內除1只小鼠外全部死亡;混合方法造模，模型小鼠骨髓活檢提示造模失敗;化學方法造模，造模成功，模型維持時間長。結論 免疫介導和混合方法造模速度快，對模型小鼠骨髓抑制明顯，與臨床急性AA接近;化學方法造模周期長，模型小鼠骨髓抑制較輕，與臨床慢性AA接近。

免疫介導;混合方法;化學方法;再生障礙性貧血

再生障礙性貧血(AA)患者多為青壯年，急性病例預后極差，僅慢性輕型病例有望獲得緩解或治愈。近年來人們為了探討AA的發病機制及篩選有效的治療藥物，做了很多的研究和探討，而研究的深入有賴于良好的AA動物模型的建立。為此，筆者曾經在研究AA的藥物治療中，曾先后三次建立AA小鼠模型，本文擬探討一種方法簡便、成功率高、維持時間較長，與人類病理改變相似的AA小鼠模型的建立方法。

1 材料與方法

1.1 方法一

1.1.1 實驗動物 近交系 Balb/c小鼠45只，全雌，體重(18±2)g，DBA/2小鼠2只，全雌，體重(18±2)g，作為細胞供者。兩者均由上海市西普爾-必凱實驗動物有限公司提供，合格證號SCXK(滬)2008-0016。

1.1.2 胸腺淋巴結細胞懸液制備 將兩只DBA/2小鼠斷頸處死，95%酒精浸泡消毒5 min后，無菌取出胸腺及頸、腋下、腹股溝等處的淋巴結，加磷酸鹽(PBS)緩沖液，除去表面血污及黏附的結締組織。再次清洗后，用手術刀、剪刀反復剪切組織，研磨直到成糊狀，再經尼龍濾血網過濾，使之成為單細胞懸液。計數后配成1×106/ml濃度備用。

1.1.3 AA模型建立 取正常BALB/C小鼠45只，隨機取其中5只作為正常對照組，其余40只參照姚軍等〔1〕方法:將Balb/c小鼠40只經6.0 Gy60Coγ射線亞致死量全身3 min照射后，4 h內由尾靜脈輸入DBA/2小鼠的胸腺、淋巴結混合細胞懸液0.2 ml，輸注細胞數為1×106/0.2 m l/只。

1.2 方法二:

1.2.1 實驗動物 ICR小鼠20只，全雄，體重(18±2)g，購于上海斯萊克實驗動物有限公司，合格證號:SCXK(滬)2007-0005。

1.2.2 實驗試劑 氯霉素(cH)陜西省西安婦幼制藥廠生產，批號:990617;環磷酰胺(CY)上海華聯制藥廠有限公司生產，批號:990406。

1.2.3 AA模型建立 20只小鼠一次全身3.0 Gy60Coγ射線照射(劑量率1.353 1 Gy/min，距離170 cm，照射時間2 min 13 s)。照射后第4、5、6天時腹腔注射環磷酰胺50.0 mg/kg及氯霉素62.5 mg/kg。

1.3 方法三

1.3.1 實驗動物 ICR小鼠50只，全雄，體重(18±2)g，由上海斯萊克實驗動物有限公司，合格證號:SCXK(滬)2007-0005。

1.3.2 AA模型建立 50只小鼠分為對照組10只:玉米油，2 ml/kg。背部皮下注射，3次/w(周一，周三，周五)，總共注射35 d。腹腔注射同體積生理鹽水，1次/d，共7次。造模組40只:苯 +玉米油(1∶1配制)，2 ml/kg(1 ml苯 +1 ml玉米油)，背部皮下注射，3次/w(周一，周三，周五)，總共注射15次。同時腹腔注射環磷酰胺溶液50 mg/kg(產品批號:11061421，江蘇恒瑞醫藥股份有限公司)。1次/d，共7次。造模持續35 d。

2 結果

2.1 方法一造模結果 給藥4 d后，造模組小鼠逐漸出現精神萎糜、大汗、皮毛稀疏、枯槁、體重明顯下降，在造模后的15 d內除1只小鼠外全部死亡。這與文獻報道的相吻合〔1〕。

2.2 方法二造模結果 造模結束后2 d，處死小鼠后，取小鼠股骨的長骨干及干骺端，甲醛溶液浸泡固定后，脫鈣，切片，然后HE染色后觀察骨髓切片病理，低倍鏡觀察組織結構:骨髓造血組織增生活躍，干骺端造血組織約占60%，骨干處增生度約為90%，可見三系各階段造血細胞，分布未見明顯異常。

2.3 方法三造模結果 造模結束后2 d，取小鼠眶靜脈血，用全自動血細胞分析儀計數做血常規計數，了解各組小鼠血常規變化。模型小鼠外周血及骨髓液流式細胞儀檢測結果，較正常組有明顯變化，顯示造模成功，且模型維持時間長。

3 討論

AA小鼠的造模方法有很多種，包括物理，化學，免疫介導及混合方法等，各種方法各有其特點。物理方法多以γ射線、x射線等以致死量或亞致死量照射;化學方法中常用的藥物有白消安(馬利蘭)、環磷酰胺、氯霉素、苯劑等。Muir等〔2〕發現單純采用放射線造模各系細胞下降較為明顯，維持周期較長，但其射線還會損傷全身各器官，毒副作用大，照射劑量亦不容易掌握。陳俊等〔3〕研究發現，單純照射后第5天骨髓干細胞數處于極低水平，但第9天起造血干細胞開始明顯增加。似乎結論有相互矛盾之處。化學藥物中，有研究發現利用白消安制造的AA動物模型，易使骨髓出現永久性損傷，而不符合造模的要求;張擎等〔4〕以環磷酰胺大劑量沖擊建立免疫紊亂動物模型，實驗動物雖有外周血常規一過性減低，但停藥后迅速回升;Lezama〔5〕單純用苯(加玉米油)誘發的小鼠再障模型，方法簡單，維持時間長，但誘導時間長達45 d。目前應用較多的模型是免疫介導的模型，即將DBA/2小鼠的胸腺淋巴結細胞(供體)輸注給受亞致死量照射的Balb/c小鼠(受體)體內，建立免疫介導AA模型。但免疫介導模型的建立實驗操作復雜，要求條件高，往往需要專業人員進行，且動物模型死亡快，有報道造模后第14天除1例外全部死亡〔1〕。

筆者先后三次造模，采用的分別是免疫介導、混合方法及化學方法，均根據相關文獻報道，由相關專業技術人員嚴格操作完成。第一次免疫介導法造模，因模型小鼠死亡快，不能滿足實驗藥物療效觀察的要求;第二次混合方法造模，骨髓活檢提示造模失敗，考慮與小鼠射線照射的劑量沒有很好把控有關;第三次化學方法造模，外周血中白細胞、紅細胞下降明顯，血小板無明顯改變，免疫T細胞及亞群中CD4+、CD4+/CD8+及CTLA-4+/CD28+的變化有統計學差異，其他雖有改變但無統計學差異，其中CD8+T細胞數、CD28+等指標的變化與文獻報道不符。

姚軍等〔1〕認為照射和淋巴細胞的輸入是造模兩個必需的條件，且要求兩者達一定劑量，任何單獨一個都不能引起造血衰竭。通過照射不僅降低了造血干細胞的數量，引起骨髓儲備力下降，而且削弱了宿主的免疫功能，使得輸入的淋巴細胞得以生存下來，通過某些途徑對宿主造血系統產生抑制。Chiu等〔6〕研究提示再障的發生是在骨髓造血干細胞數量減少到一定閾值的前提下繼發于輸入免疫活性細胞所致的免疫反應。陳俊等〔3〕實驗研究提示AA小鼠中存在抑制正常造血細胞的細胞，推測它們可能屬于T細胞，它們究竟是來源于供者小鼠的細胞，還是來源于受體小鼠本身細胞仍不清楚。而單純用苯、氯霉素、環磷酰胺等化學藥物造模的方法，操作簡便，易于控制。環磷酰胺是一種免疫抑制劑，苯對骨髓的毒性不在于苯本身而在于苯的有毒代謝產物--氫醌、苯醌等。氫醌通過抑制核因子-κB的活化而使造血前體細胞對細胞因子誘導的凋亡敏感性增高，從而產生造血抑制〔7〕。苯醌可以通過與DNA共價結合形成DNA加合物，增加了DNA的不穩定性，導致DNA損傷〔8〕。氯霉素有學者〔9，10〕認為在遺傳敏感的個體中，能直接損傷細胞DNA，造成骨髓造血干細胞和微環境的缺陷，從而導致骨髓造血衰竭。

筆者認為，AA分為急性、慢性AA，預后有明顯差異，故在發病機制上兩者有所不同。免疫介導和混合方法形成的AA模型，造模速度快，外周血象及骨髓組織中造血細胞減少明顯，肝、脾的損傷、組織壞死明顯，與臨床上急性AA比較接近;而單純化學藥物聯合造模，造模周期較長，骨髓抑制情況較輕，肝、脾的變化以體積和重量的減少為主，組織壞死不明顯〔4〕，造模小鼠存活時間長，且模型維持時間長，與慢性AA情況比較符合，能滿足實驗藥效的觀察要求。所以，AA小鼠模型的建立方法，可以根據實驗目的的不同，加以選擇。

1 姚 軍，李樹濃.淋巴細胞與再生障礙性貧血關系的實驗研究〔J〕.中華血液學雜志，1991;12(5):229-31.

2 Muir KR，Chilvers CE，HarAss C.The role of occupational and environmental exposures in the aetiology of acquired severe aplastic anaemia:a case control investigation〔J〕.Br JHaematol，2003;123(5):906-14.

3 陳 俊，趙 波，李樹濃，等.免疫誘導再障小鼠骨髓造血干細胞的改變及機理〔J〕.中山醫科大學學報，1991;12(1):32-5.

4 張 擎，彭紅娟，徐曉彬，等.環磷酰胺誘發小鼠血小板減少癥模型的建立及其血小板功能的測定〔J〕.第一軍醫大學學報，2003;23:12.

5 Lezama RU.A model for the induction of aplastic anemia by subcutaneous administration of benzene in mice〔J〕.Toxicology，2001;162:179-91.

6 Chiu KM，Knosp WH.Immunologically mediated aplastic anemia in mice:effects of varying the source and composition of donor cells〔J〕.Exp Hematol，1987;15:269.

7 Kerzic PJ，Pyatt DW，Zheng JH，et al.Inhibition of NF-kappaB by hydroquinone sensitizes human bonemarrows progenitor cells to TNF-α1 Phainduced apoptosis〔J〕.Toxicology，2003;187:127-37.

8 Levay G，BodellWJ.Potentiation of DNA adduct formation in HL60 cells by combination of benzene metabolites〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，1992;89:7105-9.

9 DaWM.In vitro studies on the pathogenesis of aplastic anemia in Chinese patients〔J〕.Exp Hematol，1988;16:336-9.

10 Abdou NI，Verdirame JD，Amare M，et al.Heterogeneity of pathogenetic mechanisms in aplastic anemia〔J〕.Ann Inter Med，1981;95:43-50.

R55

A

1005-9202(2013)23-5888-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2013.23.051

江蘇省中醫藥科技項目立項計劃(LB09060)

邢海燕(1971-)，女，碩士，副主任醫師，主要從事中西醫結合治療腫瘤、血液病研究。

〔2012-04-17收稿 2012-09-10修回〕

(編輯 曹夢園)