紫外線誘變木醋桿菌及優良突變菌種的選育

蔡興蓉，劉冬梅，許燕娜，肖性龍，袁琨

（華南理工大學輕工與食品學院，廣東廣州510640）

纖維素（Cellulose）是自然界最豐富的高分子物質，但植物中木質素、半纖維素等的存在，使得高純度纖維素的提取、精制成為工業領域的一項重大技術難題[1]。部分細菌在發酵培養液中能生產纖維素，稱細菌纖維素（Bacterial Cellulose，簡稱BC），它作為一種新型的生物材料，具有純度高、結晶度高、機械強度高、吸水量高及生物相容性好等優點，可廣泛應用于食品工業、化妝品業、造紙工業、聲音振動膜、液晶材料、人造皮膚、藥物載體等眾多領域[2-3]。

在木醋桿菌（Acetobacter xylinum）、根瘤菌屬（Rhizobium）、土壤桿菌屬（Agrobactetium）及假單細胞菌屬（Pseudomonas）等能發酵產生BC 的細菌中，木醋桿菌是產BC 能力最強的菌株[3-4]。BC 是由Acetobacter xylinum 靜止淺盤培養產生，形成凝膠狀堅固的網絡纖維膜（凈聚合物/水分=1/100），具有很好的持水性，但是這種方法存在一些弊端如淺盤表面積大易造成發酵液大量揮發損失，生長緩慢發酵時間長等，導致了生產成本的提高[5-7]；為提高BC 產量和生產菌株的穩定性，很多人進行了相關的研究：1-甲基環丙烯能提高木醋桿菌產BC 的產量[8]；采用超高壓、紫外線、亞硝酸鹽分別誘變能得到高產的菌株[9-11]；用紫外線和硫酸二乙酯進行復合誘變菌株產BC 干重為8.00 g/L[12]；在Acetobacter xylinum BPR2001 菌株中克隆了一段二鳥苷酸環化酶（DGC1）基因，構建了一株DGC1 基因缺失的突變菌株DD 在發酵罐中發酵產量提高36%[13]。盡管如此，還是普遍存在生產菌株不穩定、BC 發酵得率較低、生產成本較高及發酵原料單一等諸多問題，因此，研究提高生產菌株的穩定性、產量以及篩選經濟發酵原料顯得非常必要。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

木醋桿菌Acetobacter xylinum CGMCC 5173，為華南理工大學輕工與食品學院食品質量與安全實驗室保存菌株。

1.1.2 主要儀器

PYX2190S2A 恒溫培養箱：科力電器公司；GZX-9140MBE 數顯鼓風干燥箱：上海博訊實業有限公司；HHS-11-2 電熱恒溫水浴鍋：上海博訊實業有限公司；01J2003-04 型立式高壓蒸汽殺菌鍋：上海博訊實業有限公司；SW-CJ-1F 無菌臺：上海博訊實業有限公司；PHS-3C pH 計：上海精科實業有限公司；250 mL 錐形瓶、50 mL 錐形瓶、小平皿、大平皿、試管、涂布棒、燒杯、玻棒和紫外燈等市售。

1.1.3 主要試劑

蛋白胨、酵母提取粉、瓊脂：廣東環凱微生物科技有限公司；蔗糖、鹽酸、95 %乙醇、KH2PO4、MgSO4·H2O、（NH4）2SO4、檸檬酸、NaOH（分析純）：廣州市化學試劑廠。

1.1.4 培養基配方

1）活化用水合培養基（Mixed Medium for Reviving，簡稱MMR）：蔗糖4%、蛋白胨0.5%、KH2PO40.1%、MgSO4·H2O 0.1%、（NH4）2SO40.2%、蒸餾水100%；作斜面水合培養基為該培養基加入2.5%的瓊脂，簡稱固體MMR。

2）發酵用水合培養基（Mixed Medium for Fermentation，簡稱MMF）：蔗糖6%、蛋白胨0.2%、酵母提取粉0.1 %、KH2PO40.3 %、MgSO4·H2O 0.1 %、（NH4）2SO40.2%、檸檬酸0.1%、95%乙醇1.5%、蒸餾水100%；倒平板水合培養基為該培養基加2.5%的瓊脂，簡稱固體MMF。

3）發酵用椰汁培養基（Coconut Milk Medium for Fermentation，簡稱CMMF）：蔗糖4%、KH2PO40.3%、MgSO4·H2O 0.1%、（NH4）2SO40.4%、椰汁100%。

4）CO-MMF-CMMF：MMF 和CMMF 以4 ∶1 的比例混合得到的培養基。

1.2 方法

1.2.1 原菌株的活化

配取100 mL MMR 于250 mL 錐形瓶中經高壓蒸汽滅菌后涼卻至室溫，從冰箱中取出野生型保存菌株，在無菌條件下從種子斜面上挑取BC 膜放進MMR中于30 ℃恒溫箱活化2 d（30 ℃恒溫培養BC 產量最高[14]）。2 d 后再配取100 mL MMR，從第一瓶MMR 中吸取4 mL 含菌液體于該MMR 中，于30 ℃恒溫箱活化2 d。

1.2.2 菌株的紫外線誘變及其篩選

吸取活化好的菌液5 mL/小平皿中，將其放在紫外燈（功率為30 W）正下方25 cm 分別間隔照射3、4 min 和5 min（紫外線每照射1 min 關閉休息30 s 再照射1 min）。將誘變好的菌液分別吸取2 mL 涂布于大平皿內的固體MMF 上，于30 ℃恒溫箱靜態培養約5 d；觀察大平皿中單菌落的生長情況，挑取最大，生長BC質量最好的單菌落，即優良的菌株于新配的MMR 中活化2 d。優良菌株命名方法：如UV31 表示為經過3 min 照射的1 株誘變菌株，其它的類推。

1.2.3 BC 的發酵生產及干重測定

以6%接種量吸取活化好的優良菌菌液于MMF中靜態培養發酵，每菌株3 個平行30 mLMMF 于50 mL錐形瓶中培養；待發酵10 d 后將小錐形瓶中的菌液倒掉留下BC，往里加入0.1 mol/LNaOH 溶液使其剛好能浸沒BC，然后放到100 ℃水中水浴20 min，取出水洗中性，然后將BC 倒出于已稱過重量的小平板上，再放到烘箱中80 ℃烘約24 h 至恒重，稱取質量。纖維素的產量表示為：纖維素質量與培養基體積比（g/L）[2]，測定結果表示為產量的平均值±標準偏差。

1.2.4 續代發酵生產BC

在收獲前一代BC 前，以6%接種量吸取前一代MMF 中菌液于新配MMF 中靜態培養發酵，每菌株3個平行30 mL MMF，待發酵10 d 后收獲。稱取干重的方法同上。

1.2.5 MMF、CO-MMF-CMMF、CMMF 3 種培養基培養比較

以6%接種量吸取野生株、UV32、UV42 菌菌液于新配MMR 中活化2 d，配取MMF、CMMF、CO-MMFCMMF（每瓶/30 mL），以6 %接種量將野生株、UV32、UV42 活化2 d 的菌液分別接種到3 種培養基中，每種培養基分別做3 個平行。發酵10 d 后，比較3 組BC 的厚度、顏色、質地及干重。

2 結果與討論

2.1 紫外誘變菌株形態

紫外誘變菌株形態見圖1。

圖1 菌株木醋桿菌CGMCC 5173 經紫外線誘變不同時間后的菌落Fig.1 The colony of Acetobacter xylinum CGMCC 5173 mutated by UV for different time

通過不同時間的紫外誘變，觀察到單菌落可知，誘變3、4 min 的效果比較好，能得到單菌落較多，且得到BC 飽滿剔透，誘變5 min 菌生長單菌落極少，可見誘變5 min 的致死率很高。

2.2 優良菌株的BC 產量

誘變菌株纖維產量見表1。

表1 誘變菌株纖維產量Table 1 The BC yield of mutant strains g/L

在誘變得到單菌落中挑出個體較大，表觀較好的單菌落，分別命名為UV31、UV32、UV33、UV42、UV44、UV51，將它們進行活化并投入生產。其中UV31、UV32、UV33、UV44 第一代產量都比野生菌高，其中最高的是UV33，是野生菌的1.12 倍。如表1 所示。本研究中BC 產量范圍在26.00 g/L～36.0 0 g/L。趙瓊等紫外誘變，得到誘變菌株產量提高1.5 倍，但是產量僅為3.52 g/L[10]；文獻[15]綜述了近幾年為提高BC 進行的研究，從菌種選育到改良，再至發酵優化，BC 的干重為2.00 g/L～13.00 g/L，比與本研究的低，其可能的原因有：1）選用野生株個體存在差異；2）發酵時采用發酵容器不同，木醋桿菌為需氧菌，和氧氣的接觸面越大越有利于BC 產量的提高；3）發酵培養基不同；4）收獲周期不一樣等。經比較，本研究中所得菌株較優良，其BC產量也較高，具有開發和應用的潛力。

2.3 誘變菌株續代培養

對以上優良菌株進行續代培養，產量結果如表2所示。

表2 續代發酵細菌纖維產量Table 2 The BC yield of continued generations g/L

其中誘變菌株UV31、UV32、UV33 連續生產四代產量分別穩定在23 g/L～39 g/L、25 g/L～36 g/L、24 g/L～39 g/L。菌株UV44 和UV51 分別在第三代和第二、四代出現BC 的產量不穩定，因此沒有進一步的考慮這兩個菌株的生產情況。趙瓊等的研究表明菌株C544續代發酵產量同樣穩定，只是產量僅在3.49 g/L～3.60 g/L 之間[10]，其產量比本研究的低，表明所得的紫外誘變菌株是穩定的。

2.4 3 種培養基發酵得到BC 的形態及產量比較

用MMF、CO-MMF-CMMF、CMMF 3 種培養基培養野生菌、UV32、UV42 菌株，分析比較3 組BC 的厚度、顏色、質地及干重，結果如圖2、表3 所示。

圖2 UV33 菌株在3 種培養基中發酵的BC 形態Fig.2 The form of the BC fermented by UV32 strain in three different kinds of medium

表3 3 種不同培養基發酵產生的BC 的形態及產量對比Table 3 Contrast of form and yield of the BC fermented by three different kinds of medium

CMMF 培養BC 產量最高，為19.94 g/L～39.97 g/L，形態飽滿，即持水性好，手感柔軟，但不結實易穿透；CO-MMF-CMMF 培養BC 產量一般，為16.24 g/L～31.09 g/L，各特性比較接近CMMF 培養得到的BC；MMF 培養BC 產量最少，為10.17 g/L～22.28 g/L，但最結實不易穿透，即機械性能最好。三者的顏色也有差異，如圖2 所示。本研究驗證了BC 生物合成具有可調控性，培養方法和培養條件的不同均可影響其合成與結構[3]。故可選取不同培養基進行發酵，生產出不同特性的BC。

3 結論

本研究表明對木醋桿菌野生菌進行紫外誘變能有效地得到高產的菌株，且紫外誘變時間在3 min～4 min 為效果最佳；經篩選得到UV31、UV32、UV33、UV42、UV44 五株產量高的突變菌株，其中產量最高的是UV33，是野生菌的1.12 倍；菌株UV31、UV32、UV33、UV42 連續發酵四代產量穩定，分別為23 g/L～39 g/L、25 g/L～36 g/L、24 g/L～39 g/L。CMMF 培養能得到高產量BC，為19.94 g/L～39.97 g/L，但不結實；MMF培養能得到結實的BC 但產量低，為10.17 g/L～22.28 g/L；CO-MMF-CMMF 培養能得到較結實且產量為16.24 g/L～31.09 g/L 的BC。結果表明，紫外線誘變3 min 菌株的BC 產量有提高且3 代～4 代發酵產量保持穩定，COMMF-CMMF 發酵能得到機械性和產量均適中的BC。

這個研究只涉及到野生菌的誘變、選育以及培養發酵，未涉及到菌株的保存。由于木醋桿菌的性狀極其不穩定，容易受保存條件及保存的時間影響，所以木醋桿菌的保存非常重要。因此希望在選出優良菌種后，能對菌株的保存條件進行深入研究，以便能更好地生產BC，更好地應用于各個領域，造福人類。

[1] Cheng K C,Catchmark J M,Demirci A.Enhanced production of bacterial cellulose by using a biofilm reactor and its material property analysis[J].Journal of biological engineering,2009,3(12):1-10

[2] 曹海鵬,袁帥,趙昆,等.細菌纖維素高產菌株的篩選及鑒定[J].食品科學,2010,31(5):211-214

[3] 陸勝民,賈靜靜,楊穎.細菌纖維素發酵工藝與應用研究進展[J].食品與發酵科技,2011,47(1):27-31

[4] Peggy O S,Cannon R E. Acetobacter ylinum:An Inq uiry into Cellulose Biosynthesis[J].The american biology teacher, 2000, 62(6):442-444

[5] 薛璐,楊謙.醋桿菌產纖維素發酵條件的優化[J].食品科學,2003,24(12):58-59.

[6] Babushkinaa T A, Klimovaa T P, Shtykova é V. Study of the Gel Films of Acetobacter Xylinum Cellulose and its Modified Samples by 1H NMR Cryoporometryand Small-Angle X-Ray Scattering[J].Crystallography reports,2010,55(2):312-317

[7] Yang H,Catchark J M.Formation and Characterization of Spherelike Bacterial Cellulose Particles Produced by Acetobacter xylinum JCM9730 Strain[J].Biomacromolecules,2010,11(7):1727-1734

[8] Hu Y,Catchmar J M.Influence of 1-methylcyclopropene (1-MCP)on the production of bacterial cellulose biosynthesized by Acetobacter xylinum under the agitated culture[J].Letter in applied microbiology,2010:51(1):109-113

[9] 杜雙奎,李志西,毋銳琴,等.細菌纖維素菌株超高壓誘變選育及其發酵培養基的優化[J].高壓物理學報,2011,25(1):81-86

[10] 趙瓊,楊謙.細菌纖維素高產菌株的紫外誘變育種研究[J].食品與發酵工業,2007,33(7):26-28

[11] 邱開顏,洪楓.誘變選育木醋桿菌以提高細菌纖維素產量[J].東華大學學報,2008,34(2):181-185

[12] 王遠亮. 醋酸菌纖維素高產菌株的誘變選育及其發酵特性研究[D].南京農業大學碩士論文,2002

[13] Bae SQ,Sugano Y,Ohi K,et al. Features of bacterial cellulose synthesis in a mutant generated by disruption of the diguanylate cyclase 1 gene of Acetobacter xylinumBPR2001[J].Applied microbiology and biotechnology,2004,65(3):315-322

[14] 趙瓊,楊謙.木醋桿菌突變株產細菌纖維素發酵條件優化[J].食品研究與開發,2007,128(6):44-48

[15] 王銀存,李利軍,馬英輝,等.細菌纖維素生產及應用研究進展[J].中國釀造,2011,4:20-23