加熱與超高壓對縊蟶蛋白質變性及酶解的影響

盧婷，劉金福，劉偉，李有起

（1.鄭州大學生物工程系，河南鄭州450001；2.天津農學院食品科學系，天津300384；3.天津市食品研究所有限公司，天津301609）

超高壓技術（high pressure，HP）是一種主要的非熱加工技術。與傳統的熱加工相比，超高壓加工具有殺菌溫度低，能更好的保持食品固有的營養成分、質構、色澤和新鮮度等特點。現在國內外對超高壓加工產品的研究重點已經由抑菌、鈍酶的作用向引起產品的理化性質變化的質構、化學、營養學、生物學等更深入的方向進行。縊蟶（Sinonovacula constricta lamarck），俗稱蟶子[1]，它主要分布于西太平洋沿海的中國、日本和朝鮮，被稱為四大養殖貝類之一[2]。縊蟶肉味鮮美，是高蛋白、低熱量、低脂肪的健康海洋食品之一。現在市場上出售的主要是生鮮縊蟶或加工的蟶干，但縊蟶容易腐敗，很難長途運輸，所以嚴重限制了市場范圍。通過比較熱加工、超高壓加工與未處理生鮮縊蟶的感官品質、蛋白變性程度及酶解效果等，為縊蟶的深加工提供借鑒。

1 材料與儀器

1.1 材料

縊蟶：天津市紅旗農貿批發市場；中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶：天津市諾奧生物技術有限公司，經測酶活力分別為242 588、133 767、3 480 U/g；胃蛋白酶：四川省德陽市生化制品有限公司經測酶活力3 011 U/g。

1.2 設備

電熱恒溫水浴鍋：天津市華北實驗儀器有限公司；紫外分光光度計WFJ7200：尤尼柯（上海）儀器有限公司；電子天平JA 2003：上海舜宇恒平科學儀器有限公司；酸度計：HANNA；凱氏定氮儀UDK 159 DKL：VELP SCIEWTIFICA；離心機Anke 7DL-5：上海安亭科學儀器廠；差示掃描量熱儀（DSC）200F3：德國耐馳熱分析儀器；核磁共振儀：上海紐邁電子科技有限公司；磁力攪拌器JB-3：上海雷磁新涇儀器有限公司；真空干燥箱DZF-6210：上海精宏實驗設備有限公司；超高壓設備：天津光輝有限公司提供。

2 方法

2.1 縊蟶處理方法

熱加工：100 ℃下蒸煮5 min[3]。

超高壓加工：500 MPa，20 ℃下保壓15 min，在此反應條件下，具有較好的殺菌效果。該產品在4 ℃條件下保鮮效果很好，貨架期為8 d～9 d[4]。

2.2 酶解工藝流程

2.3 測定方法

2.3.1 蛋白酶酶活力測定

SB/T 10317-1999《蛋白酶活力測定法》。

2.3.2 縊蟶水分的測定

GB/T 5009.3-2010《食品中水分的測定》。

2.3.3 縊蟶蛋白測定

微量凱氏定氮法[5]。

2.3.4 游離氨基態氮

甲醛滴定法[5-6]。

2.3.5 水解度的測定

水解度（DH）是衡量蛋白質水解程度的重要指標，指水解斷裂的肽鍵數目占總肽鍵數目的百分比。水解斷裂的肽鍵數可通過水解釋放出的氨基態氮數目來測定，按照下面公式計算[6-7]。

2.3.6 持水性的核磁共振測定法

核磁共振（Nuclear Magnetic Resonance，NMR）是指具有固定磁矩的原子核，在恒定磁場與交變磁場的作用下，以磁電波形式吸收或釋放能量，發生原子核的躍遷，同時產生核磁共振信號，即原子核與射頻區電磁波發生能量交換的現象。根據分辨率差異可分為高低分辨率兩種類型。低場核磁共振（Low field nuclear magnetic resonance，LF-NMR）指磁場強度在0.5 T以下的核磁共振，檢測樣品的物理性質[8]。

2.3.7 蛋白質變性程度的DSC 測定

差示掃描量熱法 （Differential Scanning Calorimetry，DSC）是在程序控制溫度下，測量輸給物質和參比物功率差與溫度關系的一種技術。稱取15 mg～30 mg 的經處理后的縊蟶勻漿放入樣品池，密封后放入儀器中，以空氣作為參比物，保護氣為氮氣，生物速率10 ℃/min，從30 ℃升溫至90 ℃[9]。

3 結果與討論

3.1 不同處理的縊蟶肉質持水性分析

采用核磁共振方法，實驗參數如下：PulSeqType=2；SF1（MHz）=22；O1（kHz）=963.296 7；P90（us）=13.5；P180（us）=27.0；TD=160 040；SW（kHz）=200；D3（us）=75；TR（ms）=2 500；RG1=20；RG2=3；NS=4；EchoTime（us）=200.00；EchoCount=2 000；GA1（%）=0，對生鮮、加熱、超高壓蟶子進行核磁共振檢測，圖譜如圖1 所示。

圖1 不同處理方法縊蟶核磁共振弛豫時間分布Fig.1 NMR relaxation time distribution of Sinonovacula constricta lamarck by different treatment methods

肉制品水分的橫向弛豫時間（T2）呈多指數衰減，一般T2可以分為T21（0 ms～10 ms）、T22（10 ms～100 ms）、T23（100 ms 以上），分別對應結合水、不易流動水、自由水[10]。肌原纖維蛋白質變性對肉制品具有重要的影響，利用低場核磁共振（Low field nuclear magnetic resonance，LF-NMR）質子弛豫行為測定水分分布，可以判斷蛋白質變性情況[11]。Bertram 研究發現，T21主要與存在機體中的蛋白質結構有關，T22與肌原纖維之間的空間水分有關[12]。蛋白質變性主要是導致聚集的β-折疊構象增加，天然的β-折疊和α-螺旋結構降低，從而導致T21分布變寬，對應面積增大。同時，蛋白質結構發生變化，導致結合于蛋白質上的結合水結合的松弛，當水分結合的越緊密松弛時間越短，故而隨著蛋白質變性程度的加深，T2出峰的時間越來越靠后。

由圖1 可以看出，生鮮縊蟶T21首峰峰起時間為0.657 933 ms，面積約為16.57；加熱5 min 后縊蟶T21首峰峰起時間為1.149 76 ms，面積約為21.23；超高壓后縊蟶T21首峰峰起時間為0.869 749 ms，面積約為17.26。加熱縊蟶的峰面積＞超高壓縊蟶的峰面積＞生鮮縊蟶的峰面積，且T2的出峰時間的先后順序依次為：生鮮縊蟶、超高壓縊蟶、加熱縊蟶。無論是從T2的出峰時間還是T21的峰面積大小均可看出：加熱處理使得縊蟶蛋白質變性程度大，對蛋白質結構影響更大。

3.2 不同處理的縊蟶蛋白質變性分析

差示掃描量熱法（DSC）對研究天然聚合物的結構和熱力學特征是一種非常有效的工具，近年來逐漸被食品界用來進行蛋白質變性和組織結構變化的研究[9]。不同處理得到的縊蟶勻漿DSC 掃描圖譜如圖2。

圖2 不同處理方法的縊蟶DSC-溫度曲線Fig.2 DSC-temperature curve of Sinonovacula constricta lamarck by different treatment methods

生鮮縊蟶DSC 圖譜在35 ℃附近出現的為肌球蛋白峰，在70 ℃附近出現的為肌動蛋白峰。經過超高壓處理縊蟶的兩個峰趨于平緩，加熱處理后的峰更加平緩。表明超高壓和加熱處理使維持蛋白質結構的氫鍵斷裂，從而引起肌球蛋白和肌動蛋白發生不可逆的變性，加熱處理變性更為明顯。

3.3 產品成分及感官評價

加熱、超高壓處理后縊蟶的水分及蛋白含量與未處理生鮮縊蟶水分蛋白含量比較如表1 所示，在色澤、形態、風味及質地[13]四個方面進行感官評價，如表2 所示。

通過表1 可以看出超高壓處理后縊蟶含水量高，加熱處理使得縊蟶嚴重脫水。上述核磁共振分析的結果在感官評價中得到了同樣的反映。對兩種縊蟶成品進行感觀評價發現，超高壓處理的縊蟶肉質白色，蛋白質發生了一定的變性，但其形態變化不大，口感滑嫩；加熱處理的縊蟶肉質較老韌。可見，對縊蟶進行超高壓加工可以開發出口感獨特的產品。

表1 縊蟶水分及蛋白含量Table1 WaterandproteincontentofSinonovaculaconstrictalamarck

表2 加熱和超高壓縊蟶的感官評價Table 2 Sensory evaluation of Heating and high pressure Sinonovacula constricta lamarck

3.4 不同處理的縊蟶蛋白質的酶水解及效果

利用正交實驗，測定中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶分別酶解三種不同處理的縊蟶勻漿，測定酶解后的水解度，結果見表3、表4、表5和表6。

使用四種已知酶活力的不同蛋白酶對縊蟶進行酶解，均表現出生鮮縊蟶的水解度最大，500 MPa，15 min 超高壓處理縊蟶蛋白的水解度高于100 ℃加熱5 min 縊蟶的水解度的現象。查看資料發現，不同來源的動物蛋白變性后酶解效果不同，雞肉和蛋類蛋白質經加熱變性后，更容易酶解[14-15]，而對于魚、貝等水產品情況恰好相反，加熱蛋白質變性后，更不容易酶解[3]。本實驗也得到類似結果：加熱容易導致縊蟶蛋白質脫水和變性，對蛋白酶的酶解作用影響更大，比生鮮縊蟶蛋白的水解度明顯降低。超高壓處理也會引起縊蟶蛋白變性，但持水性較高，形態變化不大，與未處理的生鮮縊蟶接近，酶解相對容易些 由此可知，對縊蟶進行酶解加工生產蛋白肽等產品時，使用生鮮縊蟶為原料更容易獲得水解液；生鮮縊蟶、超高壓加工的縊蟶可能比熱加工的產品更易于被人體消化吸收，有待于進一步深入研究。

表3 中性蛋白酶酶解水解度Table 3 Hydrolysis degree of bacillus protease

表4 木瓜蛋白酶酶解水解度Table 4 Hydrolysis degree of papain

表5 胰蛋白酶酶解水解度Table 5 Hydrolysis degree of trypsin

表6 胃蛋白酶酶酶解水解度Table 6 Hydrolysis degree of pepsin

4 結論

通過差示掃描量熱儀（DSC）和核磁共振（NMR）的檢測分析方法，對加熱、超高壓處理的縊蟶蛋白質變性程度進行分析，100 ℃加熱處理5 min，縊蟶蛋白質變性程度要遠高于超高壓500 MPa，20 ℃，15 min 處理的產品。經感官評價，通過超高壓法制得的縊蟶產品，色澤、形態完好，口感滑嫩獨特，且可以殺菌、鈍酶，延長產品的貨架期[4]。超高壓技術是對縊蟶進行深加工，開發新產品的重要途徑。

不同蛋白酶的酶切位點不同，會導致水解度不同，同時蛋白質的變性程度和方式也會影響酶解效果。胰蛋白酶對縊蟶蛋白的水解效果最佳，而后依次為胃蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶。采用500 MPa，20 ℃，15 min 超高壓處理、100 ℃加熱處理5 min 和生鮮縊蟶原料比較，四種蛋白酶均對生鮮縊蟶蛋白質的水解度最高。

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