豬皮明膠抗氧化多肽酶解工藝優化

張閩，董文賓，張小強

（1.陜西科技大學生命科學與工程學院，陜西西安710021；2.陜西科技大學化學與化工學院，陜西西安710021）

人體衰老和疲勞等過程都涉及自由基，制備高效的活性肽，開發新型食品添加劑，評價其清除自由基活性成為首選。明膠雖具有優良的物理性質[1-2]，可作為乳化劑等廣泛應用于食品制造，每年用量達20 萬t，占整個食品級明膠市場的60%以上。但由于其生物價（20）和氨基酸評分（0）比較低，雖然粗蛋白82 % 以上，但很少作為蛋白質來源生產活性肽，產品附加值很低。本研究以我國資源豐富的豬皮明膠作為原料，采用不同酶解方法，通過清除DPPH·的方式檢測其抗氧化活性，期望為開發具有抗疲勞、抗衰老等功效的明膠活性肽提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

食品級明膠：山東淄博寶恩生物科技有限公司饋贈；胃蛋白酶、胰蛋白酶、酸性蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶（Wolsen），木瓜蛋白酶：北京奧博星生物科技有限公司；其余試劑為分析純。

1.2 儀器

835－50 型氨基酸自動分析儀：日本日立制作所；PHS-3C 型臺式PH 計：上海精密科學儀器有限公司；HHS 型恒溫水浴鍋：上海博訊實業有限公司；JJ-1型精密增力電動攪拌器：上海浦東物理光學儀器廠；高速冷凍離心機：德國Heraeus 公司；Minimate TFF system 型超濾機：英國PALL 公司；722N 可見光分光光度計：上海精密科學儀器有限公司；其它為常規儀器。

1.3 方法

1.3.1 明膠蛋白含量和氨基酸組成的測定

明膠粗蛋白含量的測定參照國標GB/T5009.5-2010，應用微量凱氏定氮法；氨基酸組成分析用氨基酸分析儀測定。

1.3.2 明膠活性肽的酶法制備

參考相關文獻[3-9]酶結構特點和pH 分類，用緩沖液在80 ℃溶解明膠，然后在酶最適活力下水解明膠，具體工藝如表1，水解完成后100 ℃加熱25 min 滅酶，水解液用高速冷凍離心機離心、過濾，澄清后超濾機篩選分子量低于4 000 u 的上清液備用。不同酶解明膠工藝條件見表1。

1.3.3 明膠多肽對DPPH·的清除作用

自由基外圍存在不成對電子，反應活性強，存在壽命短，化學性質很不穩定而難以檢測，到目前為止除了H2O2其它自由基的測定仍沒有合適方法。在評估抗氧化活性的方法中[10-11]，DPPH·具有在無水乙醇中化學性質穩定、半衰期長的特點，可通過計算清除率等參數反映抗氧化劑功效。加之該法在評價活性物功效時不受葡萄糖等雜質的干擾，重復性好，方法靈敏、操作簡單，被廣泛用于衡量樣品的抗氧化能力。

表1 不同酶解明膠工藝條件Table 1 Enzymatic gelatin process conditions

具體實驗步驟如下：用無水乙醇配置0.2 mmol/L的DPPH·溶液，先加待測液，再加無水乙醇，最后加DPPH 溶液，等混勻后在室溫下暗室靜置30 min，測517 nm 處吸收度，用下邊的公式計算樣品對DPPH·自由基的抑制率。抑制率K={1-（Ai-Aj）/Ac}×100%，式中：Ac為對照組；Ai為樣品組；Aj為空白組。

1.3.4 明膠木瓜酶解多肽對DPPH·清除活性試驗的優化設計

在單因素試驗的基礎上，以酶解溫度、pH、料液比、酶料比為影響因子，以酶解產物的DPPH·清除率為響應值，設計了4 因素3 水平共30 個試驗點的響應面法設計，對第一階段篩選出來的木瓜酶進行生產工藝優化，功效依據實驗確定。

2 結果分析與討論

2.1 明膠的蛋白含量和氨基酸組成

樣品粗蛋白含量測定為90.75%。比目前食品級明膠平均含量82%高。氨基酸組成分析結果如圖1。

其中非極性氨基酸占69.23 %，甘氨酸最高占37.38%，脯氨酸15.47%；酸性氨基酸占12.87%，堿性氨基酸占8.3%。

2.2 不同酶解明膠產物對DPPH·的清除效果分析

實驗在酶最適條件下用胃蛋白酶，酸性蛋白酶，木瓜蛋白酶，中性蛋白酶，堿性蛋白酶，胰蛋白酶水解豬皮明膠，依據DPPH·清除率檢測抗氧化肽功效，六種酶清除率分別為78.28%、91.87%、79.94%、77.83%、36.53 %、39.42 %；方差分別為0.016、0.018、0.028、0.026、0.022、0.018。清除功效都很穩定。

圖1 明膠氨基酸組成色譜圖Fig.1 The chromatograph chart of amino acid composition about pigskin gelatin

結果分析：①目前，對抗氧化肽的機理尚不清楚。一般說來，構成肽的氨基酸種類、數量及氨基酸的排列順序決定著肽的抗氧化能力。Wu[12]認為，分子量較小的肽具有更高的抗氧化活性。Niranian[13]等發現，當多肽的N 端為疏水性氨基酸，抗氧化活性較高。Suetsuna[14]等表示，活性肽通過整合金屬離子從而抑制以金屬離子為輔酶的脂質過氧化反應。此外，抗氧化肽的活性與肽中含有的某些特殊基團有關，只有在適當分子量時，特殊基團才能得到最大的暴露表現出較強的抗氧化活性。此外，對目前研究的不同種類的明膠抗氧化肽分析發現，大多具有重復的Gly—Pro 序列[15]，豬皮明膠中這兩種氨基酸含量很高，我們推測可能是水解肽抗氧化活性較高的一個原因，進一步有必要分析明膠的氨基酸順序進行驗證。②從酶的結構和pH 分類分析，酸性和胃蛋白酶屬一類，活性部位含有兩個羧基，在酸性范圍活力最適，傾向于剪切芳香族氨基酸或亮氨酸的肽鍵，當氨基端為堿性氨基酸時，水解效果很差；胰和堿性蛋白酶活性中心含有咪唑基，屬于絲氨酸酶，只能水解R1是精氨酸或賴氨酸的肽健，專一性很強；木瓜蛋白酶屬于巰基蛋白內肽酶，作用于L-精氨酸等羧基形成的肽鍵，底物特異性寬泛。中性蛋白酶屬于金屬酶類，和木瓜蛋白酶相似，中性時效果很好。六種酶活性中心和酶解位點有差異，依據對明膠組成和當前抗氧化肽研究的分析，明膠中非極性氨基酸較多，酸性氨基酸比堿性氨基酸多，適合在酸性（中性）水解，本實驗中酶類篩選與朱夕波[16]研究一致，也符合當前的理論成果。③本研究清除率高于朱夕波等的結果，原因可能如下：一是原料的不同，兩者原料分子量和蛋白含量存在差異；二是加工工藝不同，朱夕波用酶組合進行水解，清除率30%左右，本研究對工藝進行改進，利用緩沖液溶漲明膠，水解過程使用了攪拌器，酶解液經高速離心和超濾處理，活性肽分子量較小。本研究顯示需要對原料進行預處理，減小明膠的分子量，提高明膠產品的蛋白質含量，酶解中增加攪拌，產物進行粗分，選擇合適分子量的肽段可提高功效。綜合考慮，酸性蛋白酶解物抗氧化性最佳，木瓜蛋白酶等略低，但不存在統計學差異，考慮酸性蛋白酶成本較高，建議企業生產使用木瓜蛋白酶。

2.3 響應面法優化木瓜酶解條件試驗結果

應用SPSS12.0 軟件處理木瓜酶解數據，對pH（x1），酶解溫度（x2），料液比（x3），酶料比（x4）不同因子對DPPH.清除率（y）的影響進行回歸，得到方程式：

此方程式在pH（pH=3～9）、溫度（30 ℃～80 ℃）、料液比（0.01～0.06）和酶料比（0.01～0.05）范圍內，能較好的預測DPPH·清除率。如果擴大范圍，統計學檢驗顯著性不強（P＜0.05）。為此，應用Design Expert 8.0 軟件對工藝進行優化，響應面法試驗設計和結果見表2 和圖2。

表2 響應面法試驗設計和結果Table 2 Design and resunlts of RSM

圖2 木瓜蛋白酶水解明膠制備活性肽的響應面法優化Fig．2 Papain hydrolyzed gelatin preparation of active peptide response surface methodology

溫度50.05 ℃、pH 為6.16、料液比為0.043、酶料比0.04 g/g，明膠酶解多肽產物對DPPH 自由基的清除率為89.1%。采用優化的酶解條件進行驗證實驗，為方便操作，條件設為：溫度51℃、pH 為6.16、料液比為0.043 g/L、酶料比0.04 g/g，經多次實驗測得多肽產物對DPPH 自由基清除率為（87.4± 0.23）%，相對誤差為0.017，說明響應面法優化出的工藝可行。

3 結論

1）明膠酶解前對原料先用檸檬酸—Na2HCO3緩沖液預先溶漲，水解過程中通過攪拌器攪拌，水解物利用超濾法進行粗分，篩選分子量較小的肽段（＜4 000 u）可以提高水解物的抗氧化功效。

2）不同酶水解明膠產物抗氧化活性有差異，酸性蛋白酶和木瓜蛋白酶功效最佳（不存在統計學顯著性），從生產成本考慮建議使用木瓜蛋白酶進行酶解。酶動力方程式y=0.330-0.011 x1-0.003 x2+2.114x3+4.646 x4在酶活力適宜條件下可以較好的預測活性肽對DPPH·的清除率。

3）用響應面法優化的最佳水解工藝條件為：溫度50.05 ℃、pH 為6.16、料液比為0.043 g/L、酶料比0.04 g/g，明膠酶解多肽產物對DPPH·的清除率預計可達到89.1%。實驗數據為87.4%。顯示這個工藝可以指導生產。酶法水解明膠還需要對酶進行固定化，相關的問題還需要繼續研究。

[1] 馮成利,黨蕊葉,李校坤,等.豬皮膠原蛋白膚的提取及理化分析[J].陜西師范大學學報,2007,35(6):20-23

[2] 姚龍坤,顧平遠,黃文濤.明膠在食品工業中的應用簡述[J].明膠科學與技術,2009,29(1):24-25

[3] 孟歡,羅儒顯.木瓜蛋白酶水解明膠制備多肽的工藝研究[J].廣東化工,2010,37(1):36-38

[4] 黃雅欽,夏冬敏,黃明智.用酶組合技術制備水解明膠的研究[J].明膠科學與技術,2000,20(4):173-178

[5] 黃雅欽,冷延國,黃明智.明膠水解程度側定方法的探討[J].明膠科學與技術,1999,19(1):21-26

[6] 耿秀芳,李耀輝,張義軍,等.豬骨膠原蛋白降壓成分的提取與生物活性的研究[J].西安醫科大學學報,2001,22(5):418-421

[7] 焦駝文,孔繁東,祖國仁,等.酶解蛋白制備抗氧化多肽的研究現狀與展望[J].中國釀造,2007,168(3):5-7

[8] 張勤.酶法從鮮豬皮中提取生物活性肽[D].陜西:西北大學碩士學位論文,2005:35-50

[9] 沈江南,陳萬里,吳禮光.分離技術在海洋生物活性物質分離純化中的應用[J].浙江工業大學學報,2007,35(6):595-599

[10] 文鏡,賀素華,楊育穎,等.保健食品清除自由基作用的體外測定方法和原理[J].食品科學,2004,25(11):190-195

[11] 林金明,屈鋒,單孝全.活性氧測定的基本原理與方法[J].分析化學,2002,30(12):1507-1514

[12] WU H C,CHEN H M,SHIAU C Y.Free amino acids and peptides as related to antioxidant properties in protein hydrolysates of mackerel(Sconberanstr austrasicus)[J].Food research international,2003,36(9):949-957

[13] NIRANJAN R,ERESHA M,WON K J,et al.Purification of a radical scavenging peptide from fermented mussel sauce and its antioxidant properties[J].Food research international,2005,38(2):175-182

[14] SUETSUNA K,UKEDA H,OCHI H.Isolation and characterization of free radical scavenging activities peptides derived from casein[J].Nutritional biochemistry,2000,11(3):128-131

[15] RAJAOAKSE N,MENDIS E,BYUN H G,eta1.Investigation of jumbo squid(Dosidicus gigas)skin Gelatin peptides for their in vitro antioxidant effects[J].Life science,2005,77(17):2166-2178

[16] 朱夕波,周培根,李燕,張艷.豬皮膠原蛋白水解產物中的抗氧化活性肽的分離及其氨基酸組分[J].天然產物研究與開發,2009,21(1):122-124