萱草總黃酮體外抗氧化研究

白雪松，張晶瑩，李善姬

（1.吉林醫藥學院營養教研室，吉林吉林132013；2.吉林省衛生檢測檢驗中心，吉林長春130062）

萱草又名金針菜，黃花菜、忘憂草，為百合科萱草屬多年生草本植物，原產于中國南部及日本，其根、葉、莖、花在東亞地區作為食品和傳統的藥品已有幾千年的歷史[1]。萱草營養豐富，含有糖類、蛋白質、維生素、無機鹽及多種人體必需的氨基酸。在現代生活中，萱草與香菇、木耳、冬筍一起被稱為蔬菜類中的四大珍品[2]。《本草綱目》記載黃花菜有利胸膈、五臟、輕身明目、治小便赤澀、解煩熱、除酒瘟、令人好歡無憂等藥效。黃酮乃植物中廣泛存在的一種有效成分，具有保肝抗炎、鎮定補腦、延緩衰老、抗氧化自由基活性作用，此外還有降壓、降血脂、提高機體免疫力等藥理活性[3]。因此近年來黃酮類化合物成為了新藥開發研究中的一個非常重要的資源，具有廣闊的開發應用前景。

目前對萱草總黃酮的研究主要集中在提取工藝的研究，關于其抗氧化活性的研究尚未見到報道。本文對萱草總黃酮體外抗氧化作用進行了初步研究，以期為萱草資源在抗氧化功能食品、藥品及天然抗氧化劑的研究及開發領域服務。

1 材料與儀器

1.1 材料

萱草：購自吉林市；2-D-脫氧核糖（2-Deoxy-Dribose，購自Sigma 公司，CAS：533-67-5）；蘆丁標準品（中國藥品生物制品檢定所，CAS：153-18-4）；無水乙醇、乙醚、硫酸亞鐵、磷酸氫二鈉、磷酸氫二鉀、氯化鉀、三氯乙酸、2-硫代巴比妥酸蔗糖、抗壞血酸、過氧化氫等試劑均為國產分析純。

1.2 儀器

UV-1800 紫外分光光度計：日本島津；ZN-500A高速中藥粉碎機：長沙市岳麓區中南制藥機械廠；KQ-100DB 數控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；TD5A 臺式低速離心機：湖南省凱達實業發展有限公司；HHS 電熱恒溫水浴鍋：上海博訊實業有限公司醫療設備廠；SHB-111A 循環水式多用真空泵：上海豫康科教儀器設備有限公司；202-1 電熱恒溫干燥箱：天津市泰斯特儀器有限公司。

2 方法

2.1 萱草總黃酮的提取

稱取干燥粉碎的萱草粉100 g，用乙醚在60 ℃下脫脂脫色4 h，脫脂后的萱草粉按料液比1 ∶20 加入60 %乙醇，60 ℃超聲浸取40 min，提取液離心10 min（3 000 r/min）上清液即為黃酮提取液，將黃酮提取液置旋轉蒸發儀濃縮并用60%乙醇定容至50 mL，稀釋500 倍，取1 mL 稀釋液于360 nm 處的吸光度，按下列公式計算黃花菜總黃酮含量：總黃酮含量=[樣品中相當于標準蘆丁濃度（μg/mL）×稀釋倍數×100]/[萱草樣品質量（g）×測定用樣品的體積（mL）×1 000]×100%。

標準曲線的繪制精確稱取10 mg 已烘至恒重蘆丁標樣，以60%乙醇溶液溶解并定容至50 mL，搖勻即得濃度為0.2 mg/mL 標樣儲備液。取蘆丁標樣儲備液5.00 mL 于25 mL 容量瓶中，用質量分數60%乙醇溶液定容，用紫外分光光度計在190 nm～400 nm 范圍內進行吸光度掃描，2 次掃描重復平均，最大特征吸收峰為360 nm。分別移取0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL 蘆丁標樣儲備液于6 個10 mL 容量瓶中，加入質量分數60%的乙醇溶液定容，在360 nm 處測定吸光度。以濃度對吸光度進行回歸，計算回歸方程和相關系數。

2.2 抑制DPPH·作用測定

采用改進的Nagai 法[4]，樣品組取各濃度黃酮樣品提取液（20.0、40.0、60.0、80.0、100.0 μg/mL）2.0 mL，分別加入4.0 mL DPPH·60%乙醇溶液，混勻，放置30 min。于波長517 nm 處測定吸光度值，記為A樣品，對照組以60%乙醇代替黃酮提取液，加DPPH·60%乙醇溶液4.0 mL，混勻，測吸光度值，記為A對照，同時設立空白組，取各濃度黃酮樣品提取液2.0 mL，加入60%乙醇溶液4.0 mL，混勻，測吸光度值，記為A空白。每個試樣做3 次平行，取平均值，根據如下公式計算抑制率。

2.3 清除·OH 作用測定

·OH 清除活性的測定采用2-脫氧核糖氧化法[5]，每支試管分別加入5 mmol/L FeSO4，5 mmol/L EDTA，5 mmol/L 2-D-脫氧核糖各0.2 mL，與0.2 mL 不同濃度黃酮樣品混合，加入0.1 mol/L PBS 緩沖液（pH7.4）1.0 mL，0.2 mL 的5 mmol/L H2O2，37 ℃水浴4 h，加1.4%三氯乙酸、0.5%硫代巴比妥酸各1 mL。沸水浴10 min后迅速冷卻至室溫。波長532 nm 處測定各管的吸光度值A樣品。與樣品組對比，空白組不加2-D-脫氧核糖，對照組60%乙醇代替樣品，測得的吸光度為A對照。

2.4 對H2O2 誘導肝勻漿脂質過氧化的影響

取小鼠肝組織，用冷生理鹽水洗凈，冰浴下勻漿，制成1%（質量體積比）的懸浮液。取1%肝勻漿2 mL，加入樣品0.4 mL，再加入6 mmol/L FeSO40.2 mL，60 mmol/L H2O20.2 mL，對照組加0.4 mL 的60%無水乙醇，陽性對照組與以各黃酮溶度一致的VC溶液代替測得的吸光度分別是A樣品，A對照，A空白。37 ℃溫育1 h 后，加入15%三氯乙酸2.0 mL，終止反應，以3 000 r/min 離心10 min，取上清液，加0.67%硫代巴比妥酸2.0 mL，沸水浴15 min，流水冷卻，測定532 nm 處的吸光度值。

2.5 對H2O2 所致的紅細胞氧化溶血的影響

將小鼠斷頭取血，肝素抗凝，2 000 r/min 離心10 min得取沉淀即為紅細胞，用冷生理鹽水洗滌3 次，直至上層澄清無紅色，制成0.5%紅細胞懸液（質量體積比）。取懸液4 mL 加入不同濃度的樣品0.2 mL，混勻后加入0.1 mL 100 mmol/LH2O2啟動反應，37 ℃溫育1 h 后，2 000 r/min 離心10 min，加入4 mL 生理鹽水稀釋后于415 nm 波長下測定吸光度值。以0.1 mL 100 mmol/L H2O2+5%紅細胞+60%乙醇溶液為對照組，以與各黃酮提取液一致的溶度的VC溶液代替黃酮提取液作為陽性對照組。

2.6 數據處理

所有實驗數據數據處理采用Excel 數據庫錄入數據并用SPSS11.5 軟件進行分析，不同實驗組間采用t檢驗。

3 結果與討論

3.1 萱草總黃酮的提取

經紫外分光光度計分析，蘆丁標準品線性回歸方程為Y=36.121 4X+0.546 6，R=0.999 9。經計算，萱草總黃酮含量為0.536%。

3.2 萱草總黃酮抑制DPPH·作用

DPPH·自由基是一種穩定的自由基，其最大的吸收波長為517 nm。DPPH·自由基遇到提供質子的物質如抗氧化劑時就會被清除，表現為吸光度的降低[6]?；谶@個原理，物質的抗氧化活性可以用其清除DPPH·自由基的能力來表示。結果見表1。

表1 萱草總黃酮對DPPH·抑制作用（±s，n=3）Table 1 Inhibition effect of DPPH·by total flavonoids from Hemerocallis fulva L（±s，n=3）

表1 萱草總黃酮對DPPH·抑制作用（±s，n=3）Table 1 Inhibition effect of DPPH·by total flavonoids from Hemerocallis fulva L（±s，n=3）

注：*萱草總黃酮組與對照組比較，P＜0.05；“—”表示空白。

?

由表1 數據可知，萱草總黃酮提取液對DPPH·具有較高抑制作用，在20 μg/mL～100 μg/mL 范圍內可見，隨濃度的增加，對DPPH·的抑制率明顯增強，且抑制率與黃酮的濃度呈一定量效關系。

3.3 萱草總黃酮清除·OH 作用

·OH 是目前所知活性氧中對生物體危害最大的一種自由基，對細胞內DNA 的破壞作用最大?；钚匝跛鶎е碌腄NA 損傷在細胞里的積累被認為是機體老化的主要原因[7]，因此研究·OH 的清除作用具有重要的應用價值。萱草總黃酮自身可作為優良供氫體，向活潑自由基提供氫后，通過共振雜化與其它自由基結合成穩定二聚體，抑制率值越大表明供氫能力越強，即還原能力越強，越能發揮抗氧化作用。結果見表2。

表2 萱草總黃酮對·OH 抑制作用（±s，n=3）Table 2 Inhibition effect of·OH by total flavonoids from Hemerocallis fulva L（±s，n=3）

表2 萱草總黃酮對·OH 抑制作用（±s，n=3）Table 2 Inhibition effect of·OH by total flavonoids from Hemerocallis fulva L（±s，n=3）

注：*萱草總黃酮組與對照組比較，P＜0.05；“—”表示空白。

?

由表2 數據可知，萱草總黃酮在較低濃度20 μg/mL時，對·OH 有較弱清除作用，但隨著濃度的增加，清除率逐漸增加，且清除率與黃酮的濃度呈一定量效關系。

3.4 萱草總黃酮對H2O2 誘導肝勻漿脂質過氧化的影響

硫代巴比妥酸法[8]測定脂質過氧化物的原理是基于一分子丙二醛可與兩分子硫代巴比妥酸發生縮合反應，在酸性條件下形成在波長532 nm 處有最大吸收的紅色化合物。丙二醛（MDA）是脂質過氧化的降解產物之一，其含量變化可間接反映被測體系中發生脂質過氧化的程度。結果見表3。

表3 萱草總黃酮對H2O2 誘導肝勻漿脂質過氧化影響（±s，n=3）Table 3 Inhibition effect of H2O2 induced lipid peroxidation by total flavonoids from Hemerocallis fulva L（±s，n=3）

表3 萱草總黃酮對H2O2 誘導肝勻漿脂質過氧化影響（±s，n=3）Table 3 Inhibition effect of H2O2 induced lipid peroxidation by total flavonoids from Hemerocallis fulva L（±s，n=3）

注：*與VC 組比較，P＜0.05；“—”表示空白。

?

從表3 中可以看出，VC溶液和萱草黃酮溶液均能較好地抑制由Fenton 反應產生的·OH 誘導的離體肝細胞丙二醛的生成。在試驗濃度范圍內，各組的抑制作用隨濃度的增加而逐漸增大，表現一定的量效關系，且在同濃度下，萱草黃酮樣品的抑制率大于VC溶液，差異具有統計學意義（P＜0.05）。

3.5 萱草總黃酮對H2O2 所致的紅細胞氧化溶血的影響

紅細胞在體外因自身氧化或者誘導氧化細胞膜破裂而發生溶血，當加入抗氧化物質時，可抑制或減緩紅細胞氧化的過程[9]。從表4 中可以看出，萱草黃酮濃度從20 mg/mL 增加到100 mg/mL 時，萱草黃酮對紅細胞的溶血有抑制作用，且隨著濃度增加，抑制率明顯提高，當濃度為100 mg/mL 時，萱草黃酮對H2O2紅細胞氧化溶血的抑制率可達55.03%。萱草黃酮對紅細胞的溶血抑制作用低于VC溶液，差異具有統計學意義（P＜0.05）。結果見表4。

4 結論

本實驗結果表明，萱草總黃酮有較強的抗氧化活性，能顯著抑DPPH·、·OH 自由基，并能有效抑制紅細胞膜的氧化損傷，保護細胞膜，顯著抑制H2O2所致的紅細胞溶血，對體外溫育和H2O2誘導的肝勻漿丙二醛（MDA）生成具有較強抑制作用。

表4 萱草總黃酮對H2O2 所致的紅細胞氧化溶血的影響（±s，n=3）Table 4 Inhibition effect of H2O2 induced oxidative hemolysis of red blood cells by total flavonoids from Hemerocallis fulva L（±s，n=3）

表4 萱草總黃酮對H2O2 所致的紅細胞氧化溶血的影響（±s，n=3）Table 4 Inhibition effect of H2O2 induced oxidative hemolysis of red blood cells by total flavonoids from Hemerocallis fulva L（±s，n=3）

注：*與VC 組比較，P＜0.05；“—”表示空白。

?

[1] Tai C Y,Chen B H.Analysis and stability of carotenoids in the flowers of daylily(Hemerocallis disticha)as affected by various treatments[J].Journal Agriculture and Food Chemistry,2000,48(12):5962-5968

[2] 鄧放明,尹華,李精華,等.黃花菜應用研究現狀與產業化開發對策[J].湖南農業大學學報:自然科學版,2003,29(6):529-532

[3] 徐任生,葉陽,趙維民.天然產物化學[M].北京:科學出版社,2004:562-564

[4] Nagai T,Inoue R,Inoue H,et al. Preparation and antioxidant properties of water extract of propolis[J].Food Chemistry,2003,80:29

[5] 金鳴,蔡亞欣,李金榮.鄰二氮菲-Fe2+氧化法檢測H2O2/Fe2+產生的羥自由基的新方法[J].生物化學與生物物理進展,1999,26(2):553-555

[6] Amarowicz R,Pegg R B,Rahimi Moghaddam P,et al.Free- radical scavenging capacity and antioxidant activity of selected plant species from the Canadian prairies[J].Food Chemistry,2004,84(4):551-562

[7] Bernstein C.Sex and DNA Repair[M].Newyork:Academic Press,1991:166

[8] 婁翠,湯順清.海帶巖藻多糖的抗脂質過氧化作用研究[J].中國釀造,2011,21(8):25-28

[9] 黃曉蘭,閻俊,吳曉文,等.枸杞多糖對H2O2誘導的小鼠生殖細胞損傷的影響[J].食品科學,24(12):116-118