蕤核葉總黃酮分離純化工藝的研究

韓蕾，趙國建，李雪姣，邰源臨，魏學智，*

（1.山西師范大學生命科學學院，山西臨汾041004；2.山西師范大學工程學院，山西臨汾041004 3.水利部水土保持植物開發管理中心，北京100083）

蕤核（Prinsepia uniflora Batal.）又名蕤李子（救荒本草），扁禾木（樹木分類學），茹茹（山西）等，屬薔薇科（Rosaceae） 李亞科（Prunnoideae focke） 扁核木屬（Prinsepia Royle）的落葉灌木。主要分布于河南、山西、陜西、內蒙古等省區，生長在900 m～1 100 m 山坡陽處或山腳下，是喜光、耐旱、耐寒的陽性樹種。果實風味獨特，酸甜適口，果仁可入藥，養肝明目，是一種具有經濟價值野生植物資源[1]。黃酮類化合物（flavonoids）是高等植物體內普遍存在的一大類重要的次生代謝產物，對人類的衰老、腫瘤、心血管等疾病的預防和治療具有重要意義[2-3]。

目前有關蕤核黃酮類物質的研究報道甚少[4]，對總黃酮分離純化的工藝條件未見報道，因此本試驗選取4 種大孔樹脂進行靜態吸附解吸及靜態動力學研究，篩選出最佳的樹脂類型并確定其最佳工藝條件，為蕤核葉總黃酮的分離純化奠定了理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料蕤核葉片，于2011年8月采自山西省臨汾市龍祠村。葉片除雜、洗凈、烘干，用粉碎機粉碎，過60 目篩置于塑封袋中備用。

1.2 儀器

RE-52A 型旋轉蒸發儀：上海青浦滬西儀器廠；SHB-Ⅱ型循環水式多用真空泵：鄭州長城科工貿有限公司；721 型可見分光光度計：上海天普分析儀器有限公司；101-3BS 型電熱鼓風干燥箱：金壇市榮華儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樹脂的預處理

用無水乙醇浸泡24 h，使樹脂充分溶脂，以濕法裝柱，乙醇洗脫至流出液乙醇-水（1 ∶5）不成白色渾濁為止，然后用蒸餾水洗至無醇味，取出樹脂備用[5]。

1.3.2 蕤核葉總黃酮提取液制備和含量測定

取葉片粉末適量，按料液比1 ∶25，體積分數為60 %乙醇在70 ℃超聲波儀器中，輔助提取50 min 后抽濾，重復3 次，合并濾液濃縮，用石油醚反復萃取直到醚相基本無色，去除色素等脂溶性的雜質，水相用3 倍～4 倍量95 %乙醇沉淀去除多糖、蛋白質等雜質[6]。

測定含量參照梁曉華[7]的方法，以蘆丁為標準品，510 nm 處測吸光值，繪制標準曲線，得到回歸方程：A=0.011 3C+0.000 5（R2=0.999 8），式中：C 為總黃酮濃度，（mg/L）；A 為吸光度。

1.3.3 靜態吸附與解析

準確稱取處理好的4 種樹脂1 g 置于100 mL 錐形瓶中，加入黃酮提取液45 mL,封口后，室溫下振蕩24 h，使其充分吸附后，吸取上層液按1.3.2 的方法測定黃酮濃度。將靜態吸附飽和后的4 種樹脂抽濾干，轉至另4 個干凈的100 mL 錐形瓶中，加入60%乙醇溶液45 mL，封口后，室溫下振蕩解吸24 h，同法測定解吸液中黃酮濃度。計算各大孔樹脂對蕤核葉片黃酮的靜態吸附量、解吸率[8]。

吸附量（mg/g）=（提取液濃度-吸附后剩余溶液濃度）×上樣液體積/樹脂質量

解吸率=[解吸液濃度×洗脫液體積/（提取液濃度-吸附后剩余溶液濃度）×上樣液體積]×100%

1.3.4 靜態吸附動力學分析

準確稱取處理好的大孔樹脂1.00 g 于100 mL 錐形瓶中，加入45 mL 提取液后振蕩至吸附平衡，每隔1 h 取上層液測定吸光值，繪制吸附動力學曲線。

1.3.5 最適樹脂分離純化黃酮的工藝條件

1.3.5.1 提取液pH 的篩選

取2 g 預處理后的樹脂于100 mL 錐形瓶中，分別加入pH2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0 的提取液,吸附飽和后測定黃酮的濃度，計算不同pH 條件下樹脂的吸附量。

1.3.5.2 上樣液濃度的篩選

取2 g 預處理后的樹脂于100 mL 錐形瓶中，依次加入50 mL 不同濃度的提取液1、2、3、4、5 mg/mL，充分吸附后測定黃酮濃度。

1.3.5.3 上樣量的篩選

取2 g 預處理后的樹脂于100 mL 錐形瓶中，分別加入10、16、20、26、30 mL 的提取液，充分吸附后測定黃酮的濃度。

1.3.5.4 洗脫劑濃度的篩選

將經過預處理的樹脂濕法裝柱，按照已確定的最佳條件上樣，充分吸附后，蒸餾水洗至無糖反應（Molish 反應），用濃度分別為30%、40%、50%、60%、70%、80%的乙醇溶液洗脫，洗脫流速為2 mL/min，測定黃酮的濃度。

1.3.5.5 洗脫劑用量的篩選[9]

按照最佳條件上樣、吸附和洗脫，洗脫速度為2 mL/min，每收集0.5 BV 體積測定其黃酮的濃度，共收集6 BV 體積，繪制洗脫曲線，確定洗脫劑的用量。

2 結果與分析

2.1 4 種樹脂的靜態吸附率和解析率

4 種樹脂的靜態吸附率和解析率，結果見表1。

表1 不同型號樹脂飽和吸附率和解析率Table 1 Adsorption capacity and desorption rate of different kinds of macroporous resins

大孔吸附樹脂的純化是利用特殊的吸附劑-大孔吸附樹脂的吸附性和分子篩相結合的原理，從提取液中有選擇地吸附住有效成分，去除雜質[10-11]。不同的樹脂對于黃酮的純化效果不同，為了更大限度的回收有效成分黃酮，考察樹脂的吸附率和解析率尤為重要。由表1 可知，大孔樹脂AB-8 吸附率為76.96%，DM-130 吸附率為75.44%，兩種樹脂的吸附效果接近，從解析率來看，AB-8 的解析率明顯的高于另外3 種樹脂，達到81.93%?；谠囼灲Y果和綜合考慮，初步確定AB-8 大孔樹脂是純化蕤核葉總黃酮的最佳樹脂。

2.2 靜態吸附動力學曲線

對大孔樹脂進行吸附動力學研究，結果見圖1。

圖1 靜態動力學曲線Fig.1 Static adsorption curvc of total flavonoids

由圖1 可知，4 種樹脂在4 h 內吸附速度較快，4 h～5 h 基本達到飽和，5 h 后黃酮濃度趨于平穩，其中大孔樹脂AB-8 對蕤核葉黃酮的吸附能力最強，結合上述樹脂的吸附率和解吸率，適合純化黃酮類物質不僅有較好的吸附能力，而且有較好的解吸能力，同時節約時間，在工業化生產中能提高生產效率。所以選擇AB-8 型大孔樹脂作為純化蕤核葉總黃酮的樹脂。

2.3 AB-8 純化蕤核葉總黃酮工藝的確定

2.3.1 提取液pH 的篩選

黃酮類化合物是多羥基酚類，成弱酸性，在弱酸或酸性條件下吸附效果較好[12]。提取液pH 的不同，樹脂對蕤核葉總黃酮的吸附效率也不同，結果見圖2。

圖2 提取液pH 對吸附量的影響Fig.2 Effect of pH value sample solution on adsorption

由圖2 可知，提取液的pH 為4 時吸附率最高，隨著pH 的增大，吸附率降低，所以確定提取液pH 為4時吸附效果最好。

2.3.2 上樣液濃度的篩選

上樣液濃度對吸附量的影響見圖3。

從圖3 上樣液濃度對吸附量的影響曲線中可以看出，隨著蕤核葉總黃酮提取液濃度的增加，樹脂的吸附量先升后降，當濃度達到2 mg/mL 時，吸附量最大，之后吸附量出現了降低的趨勢，所以蕤核葉總黃酮的濃度在1 mg/mL～2 mg/mL 時吸附效果最佳。

圖3 上樣液濃度對吸附量的影響Fig.3 Effect of sample concentration on adsorption

2.3.3 上樣量的篩選

上樣液量與樹脂比對吸附量的影響見圖4。

圖4 上樣液量與樹脂比對吸附量的影響Fig.4 Effect of ratio sample solution to resin on adsorption

由圖4 顯示，在樹脂量一定的情況下，添加同一濃度不同量的上樣量，上樣量與樹脂的比為8 ∶1 時吸附量最大。上樣量少時，吸附量大，但純化周期長，上樣量多時，達到樹脂的飽和吸附量后，會造成部分黃酮的損失，樹脂吸附率降低。所以上樣量與樹脂的比例為8 ∶1 時吸附效果最佳。

2.3.4 洗脫劑濃度的篩選

洗脫劑濃度對解吸率的影響見圖5。

圖5 洗脫劑濃度對解吸率的影響Fig.5 Effect of eluent concentration on desorption rate

由圖5 可知，不同濃度的乙醇溶液洗脫的效果不同，乙醇濃度達到60%時洗脫率最高，繼續增加乙醇濃度，洗脫率的變化不大，考慮到溶劑成本，確定60%的乙醇溶液是最佳洗脫溶劑。

2.3.5 洗脫劑用量的篩選

洗脫劑用量影響見圖6。

圖6 洗脫劑用量的影響Fig.6 Effect of eluent solvent amount

在樹脂的洗脫過程中，洗脫劑的用量過少時，黃酮不能完全被洗脫，用量太多，對于后期的濃縮帶來不便，也會造成時間過長和試劑的浪費。由圖6，在收集的第3 份至第6 份洗脫液為清澈的黃色溶液，此時總黃酮濃度最大。隨著洗脫劑用量的增加，洗脫液顏色逐漸變淺，當收集到第8 份時洗脫液幾乎無色，經檢測黃酮含量極少，即第8 份已被完全洗脫，以樹脂體積計，洗脫劑約為4 BV。

3 討論與結論

大孔吸附樹脂是由可聚合成分與添加劑經懸浮或反懸浮聚合反應制備而成，具有大孔結構的高分子吸附分離材料。其吸附作用源于范德華力或氫鍵作用，吸附選擇性源于其中的功能基及其網狀結構的篩分性能[13]。因此樹脂的篩選至關重要。大孔吸附樹脂具有吸附容量大、吸附速度快、再生方便等優點，已被廣泛應用于醫藥工業、化學工業、分析化學等領域[14]。

本文通過4 種樹脂對蕤核葉總黃酮吸附和解吸性能的分析，綜合考慮吸附率、解析率和靜態吸附動力學三方面因素，篩選出AB-8 型樹脂最適合于蕤核葉總黃酮的分離純化。接著對影響純化效果的工藝參數進行了研究，首次對上樣液濃度、上樣液用量、洗脫劑的濃度、洗脫劑的用量等因素的研究，得到AB-8 樹脂最佳純化工藝條件：提取液pH 為4，吸附時間4 h，上樣液的濃度為1 mg/mL～2 mg/mL，上樣量與樹脂之比8 ∶1；洗脫劑選用60%乙醇，用量4 BV。通過實驗結果分析，應用AB-8 型大孔樹脂純化的最佳工藝條件，蕤核葉總黃酮的純度由15.3%提高到48.6%。

本試驗在純化處理之前，對粗提液進行了石油醚脫脂等預處理，有效防止葉綠素及其雜質造成樹脂的污染和堵塞，提高樹脂純化效果并降低成本。

[1] 斯琴,敖特根,布仁吉雅,等.蕤核果實營養成分分析[J].內蒙古草業,2007,19(1):55-63

[2] Chung H S,chang L C,Lee S K,et al, Flavonoid Constituents of Chorizanthe diffusa with Potential Cancer Chemopreventive Activity[J].J Agric Food Chem,1991,471:36-41

[3] Middleton J R.Biological properities of plant flavonoid:anovrview[J].Int J P Harmacognos,1996,34:344-348

[4] 張秀秀,魏學智,張強,等.響應面法優化蕤核葉片總黃酮提取工藝[J].中國野生植物資源,2011,30(2):27-31

[5] 尹蓉莉,江靖,張淑儒,等.大孔吸附樹脂純化白芍總苷的工藝研究[J].中醫藥信息,2002,19(2):23-25

[6] 睢玉祥,張家銘,穆楠,等.翅果油樹葉總黃酮分離純化工藝研究[J].植物研究,2010,30(3):373-378

[7] 梁曉華,徐成東,王陸琴.云南13 種蕨類植物中總黃酮的測定[J]. 安徽農業科學, Journal of Anhui Agri Sci,2008,36(19):7965-7966

[8] 趙占義,孫學斌,陳明剛,等.大孔樹脂純化衛矛總黃酮的工藝研究[J].植物研究,2009,29(1):124-128

[9] 李瑞光,劉鄰渭,鄭海燕,等.大孔樹脂分離純化蘆葦葉總黃酮[J].食品研究與發,2009,30(3):60-64

[10] 何琳.陜北蕎麥麩皮中黃酮類化合物的提取及純化研究[D].陜西:陜西科技大學,2011

[11] 于智峰,王敏,金穎.大孔吸附樹脂對苦蕎黃酮吸附分離特性研究[J].食品研究與開發,2006,27(11):1-4

[12] 吳春,陳林林.大孔吸附樹脂分離純化菟絲子黃酮的研究[J].中草藥,2006,37(11):163-166

[13] 李潔.大孔吸附樹脂在天然產物分離純化中的應用研究[D].甘肅:蘭州理工大學,2010

[14] 于智峰,王敏.大孔吸附樹脂在黃酮類化合物分離中的應用[J].中藥材,2006,29(12):1380-1384