組織因子陽性微粒對(duì)血栓形成影響的研究進(jìn)展

賀紅莊 陳洪昌 張晶晶

組織因子陽性微粒對(duì)血栓形成影響的研究進(jìn)展

賀紅莊 陳洪昌 張晶晶

組織因子陽性微粒；血栓形成；影響；研究進(jìn)展

血栓形成是心血管疾病發(fā)生的極高危影響因素，很容易發(fā)展為心血管疾病，嚴(yán)重影響了住院患者的生存時(shí)間和生活質(zhì)量，因此血栓形成的原因一直是臨床廣泛關(guān)注的焦點(diǎn)。在眾多的原因當(dāng)中，組織因子陽性微粒是最近才被人們重視的一種生物學(xué)物質(zhì)，對(duì)血栓形成很可能具有較強(qiáng)的促進(jìn)作用。現(xiàn)將組織因子陽性微粒與血栓形成的相關(guān)性研究進(jìn)展予以概述。

1 組織因子陽性微粒

1.1 組織因子陽性微粒的來源早在1946年，Chargaff和West兩位學(xué)者發(fā)現(xiàn)血小板游離血漿中存在一種促進(jìn)血栓形成的因素，但是首次提出循環(huán)微粒概念的學(xué)者是Woff，當(dāng)時(shí)命名為“血小板粉塵”[1]。細(xì)胞凋亡和血管細(xì)胞活化的作用，促使組織因子陽性微粒的釋放[2]，同時(shí)還來源于紅細(xì)胞、單核細(xì)胞、血小板等。無核細(xì)胞（如血小板和紅細(xì)胞）不進(jìn)行典型的凋亡，但在激活狀態(tài)下也易產(chǎn)生微粒，健康者血漿中80%以上來源于血小板，在病理狀態(tài)下，紅細(xì)胞、白細(xì)胞等可相對(duì)于生理狀態(tài)下產(chǎn)生更多的微粒[9]。后來，學(xué)者們稱其為“組織因子陽性微粒”、“促凝微粒”、“囊泡”等眾多名稱。微粒大小不等，直徑波動(dòng)在0.05～1.0微米之間，主要由蛋白質(zhì)和脂類組成[1-3,7]。這種微粒在血液當(dāng)中，構(gòu)成了細(xì)胞損傷的可靠標(biāo)志，當(dāng)細(xì)胞損傷后在組織中保持為固態(tài)或是迅速呈遞給吞噬細(xì)胞清除[2]，同時(shí)微粒促進(jìn)了止血和炎癥反應(yīng)、血管重塑、血管生成、細(xì)胞生存、和細(xì)胞凋亡，這些過程都參與了動(dòng)脈粥樣硬化的形成[2-3]。健康人群的血液中若是促凝血微粒高水平往往與血栓形成有關(guān)系[2]。除了是細(xì)胞損傷的標(biāo)志外，促凝血微粒在動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程中直接對(duì)血管和學(xué)細(xì)胞發(fā)揮作用。在病理情況下，循環(huán)微粒可能促進(jìn)細(xì)胞間的相互作用導(dǎo)致血管炎和組織重構(gòu)，內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂，白細(xì)胞粘連和機(jī)體應(yīng)激[2]。暴露膜磷酰氨酸和功能性組織因子，這兩個(gè)促凝血物質(zhì)傳遞給循環(huán)微粒，在血管損傷部位p-選擇素激活血管內(nèi)皮細(xì)胞或血小板暴露導(dǎo)致促凝血微粒迅速聚集，用促凝血微粒對(duì)抗p-選擇素、糖蛋白配體-1、和血源性轉(zhuǎn)移因子，因此引發(fā)血液凝固[3-4]。促凝微粒還可以刺激人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)組織因子[5]。有趣的是，組織因子表達(dá)于血漿中的質(zhì)膜組成的結(jié)合體就是組織因子陽性微粒，其形成是由于細(xì)胞膜不對(duì)稱分布的磷脂在斷裂的同時(shí)會(huì)以出牙的方式脫落形成的小泡狀結(jié)構(gòu)，靜息細(xì)胞中，細(xì)胞質(zhì)的小葉主要是由磷脂酰絲氨酸和磷脂酰乙醇胺構(gòu)成，胞外小體主要是鞘磷脂和磷脂酰膽堿合成的，這些磷脂的分布是由氨基磷脂轉(zhuǎn)位酶調(diào)控的，當(dāng)細(xì)胞被激活后，通常是鈣通道的激活伴隨著酶控下磷脂酰絲氨酸異位，磷脂酰絲氨酸由質(zhì)膜內(nèi)層進(jìn)入外層產(chǎn)生微粒，另外，血小板激活產(chǎn)生微粒的過程中，需要激活V11a、IXa、Va、和Xa凝血因子[11-13]。組織因子激活后從而啟動(dòng)外源性凝血系統(tǒng)，發(fā)生血液凝固，引發(fā)血栓形成。研究還發(fā)現(xiàn)，凝血微粒積聚后，激活X因子，啟動(dòng)內(nèi)源性凝血系統(tǒng)，促進(jìn)血栓級(jí)聯(lián)放大作用[2,6]，最終導(dǎo)致體內(nèi)血栓廣泛形成。

1.2 組織因子的生物學(xué)特性對(duì)于活化的血小板，循環(huán)微粒提供了在促凝血磷脂表面形成的具有凝血級(jí)聯(lián)作用的酶復(fù)合物。他們的催化性能依賴于凝血陰離子，氨基磷脂，氨基酸絲氨酸，易位外胞漿層后膜重塑。一旦進(jìn)入血液循環(huán)的因子，氨基酸絲氨酸能使局部的凝血酶的濃度達(dá)到動(dòng)力學(xué)需要的水平，凝血酶生成和有效的止血。事實(shí)上，屏蔽豐富的磷酯酰絲氨酸減輕催化效率分別是組織酶和凝血酶原復(fù)合物的200和1000倍。另外，磷酯酰絲氨酸大大提高了凝血活性因子，是細(xì)胞凝血的主要發(fā)起者[2]。同時(shí)，人們還發(fā)現(xiàn)并證明伴隨著組織因子陽性微粒聚集的血小板形成是依賴于p-選擇素糖蛋白配體1（P-selectin glycoprotein lingand-1, PSGL-1）[4]。Butenas等[14]發(fā)現(xiàn)，在正常人血漿中組織因子陽性微粒聚集不會(huì)激發(fā)體內(nèi)血栓的形成，血小板激活也不會(huì)導(dǎo)致組織因子抗原活性增多。在病理狀態(tài)下，如2型糖尿病患者組織因子陽性微粒的數(shù)目比健康者增加2倍以上[15]，還有研究發(fā)現(xiàn)[16]糖化血紅蛋白水平欠佳的糖尿病患者體內(nèi)組織因子陽性微粒促凝活性是上升的，糖尿病患者發(fā)生急性心肌梗死期間，血小板、內(nèi)皮細(xì)胞、單核細(xì)胞源性的組織因子陽性微粒是增多的，可能是加重血管閉塞的原因。

1.3 組織因子陽性微粒標(biāo)本的留取和保存血中微粒數(shù)目相關(guān)少，檢測準(zhǔn)備的標(biāo)準(zhǔn)化要求非常重要。實(shí)驗(yàn)檢測前內(nèi)容包括血樣本的采集、分離和存儲(chǔ)。分離又包括微粒懸液的離心和懸浮。抗凝劑的選擇目前尚有爭議，現(xiàn)在最常用的是枸櫞酸鈉，也有人認(rèn)為抗凝劑可同樣用來抗凝，其他可能影響是止血帶導(dǎo)致靜脈血瘀滯，存儲(chǔ)微粒懸液溫度和采集完成帶檢測之間的存儲(chǔ)時(shí)間等。微粒是通過提取乏血小板血漿或血液超離心得到的，研究表明，經(jīng)乏血小板血漿提取途徑，40%的健康者通過流式檢測不出組織因子微粒，另外，存儲(chǔ)過程中微粒懸液凍融會(huì)給實(shí)驗(yàn)結(jié)果帶來影響，數(shù)據(jù)表明磷酯酰絲氨酸表達(dá)annexin+在凍融的情況下表達(dá)提高了20倍，說明凍融可以促使微粒表面膜上磷酯酰絲氨酸向血漿中釋放。

1.4 組織因子陽性微粒的檢測目前研究檢測血小板微粒的方法最多，其中流式細(xì)胞儀技術(shù)被認(rèn)為是最普遍的手段，流式檢測血小板微粒時(shí)通過鎖定annexinv這一結(jié)合位點(diǎn)標(biāo)志和血小板特異性抗原（CD41，CD42 CD61 CD62），這樣可以有效地排除白細(xì)胞和紅細(xì)胞源性微粒的干擾。Robert等通過流式實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)證明，利用0.5微米和0.9微米熒光小球以2：1的比例設(shè)門，并鎖定annexine和CD41兩個(gè)標(biāo)志，同一標(biāo)本在不同時(shí)間檢測出微粒數(shù)變異小，可重復(fù)性強(qiáng)。流式細(xì)胞儀缺點(diǎn)在于噪聲環(huán)境下檢測維蘭德特異性和敏感性不足。其具體方法如下：①待測樣本染色準(zhǔn)備。a，每組樣本取100微升，加入100微升HEPES離心液，暗室中加入10微升熒光抗體，暗室中溫培育30min。4攝氏度密封保存過夜。b，樣品加入4微升FITC-AnnexinV熒光抗體，暗室中培育30分鐘。C，樣品加入200微升HEPES離心液，吹打混勻。d，上機(jī)前每組樣品準(zhǔn)確加入6微升標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)顆粒100微升，并輕吹打混勻。②樣品檢測和分析。a，每批次測量樣本之前都需要用標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行控制和參數(shù)矯正。b，計(jì)數(shù)測量停止以P2門收集滿10000個(gè)6微升標(biāo)準(zhǔn)計(jì)數(shù)顆粒為止。C，定義出現(xiàn)在p1門內(nèi)，且FITC陽性的事件為膜微粒。其中同時(shí)有染色陽性的事件為組織因子陽性微粒。C，膜微粒及組織因子微粒的計(jì)數(shù)公式：N=E*96000/10000*600。E表示P1門中所有事件計(jì)數(shù)；96000為加入的100微升計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)顆粒總數(shù)；10000為P2門記錄的計(jì)數(shù)顆粒數(shù)；600為總稀釋倍數(shù)。（注意：當(dāng)流式細(xì)胞儀出現(xiàn)液流不穩(wěn)時(shí)，需要調(diào)整參數(shù)后重新測定）

2 組織因子陽性微粒在血栓方面的研究

2.1 動(dòng)脈粥樣硬化性疾病組織因子陽性凝微粒是動(dòng)脈粥樣硬化的一個(gè)危險(xiǎn)成分。血液循環(huán)當(dāng)中高濃度的血小板，單核細(xì)胞，或內(nèi)源性的促凝微粒與心血管的危險(xiǎn)因素密切相關(guān)，這似乎暗示了不好的臨床結(jié)果。除了是一個(gè)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的標(biāo)志外，促凝微粒交叉性地在動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程直接對(duì)血管或血液細(xì)胞發(fā)揮作用。在病理環(huán)境下，循環(huán)促凝微粒可能促進(jìn)細(xì)胞間相互交流導(dǎo)致血管炎癥和組織重構(gòu)，內(nèi)皮細(xì)胞的功能紊亂，白細(xì)胞粘連和機(jī)體應(yīng)激。暴露膜磷酯酰絲氨酸和功能行的組織因子，這兩個(gè)促凝血單位傳遞給循環(huán)促凝微粒。在血管損傷部位，P-選擇素激活的血管內(nèi)皮細(xì)胞或血小板暴露導(dǎo)致促凝微粒迅速聚集，用組織因子陽性凝微粒來對(duì)抗P-選擇素，糖蛋白配體-1和血源性的轉(zhuǎn)移因子，因此引發(fā)血液凝固。在動(dòng)脈粥樣硬化板塊中，聚集的促凝微粒構(gòu)成了轉(zhuǎn)移因子作用的主要場所，促進(jìn)血液凝固后，板塊侵蝕或破裂。損傷區(qū)域的促凝微粒，最終隱藏的水解蛋白和血管效應(yīng)因子是在板塊易損性中另加入的成分[2]。急性冠狀動(dòng)脈綜合癥中，隨著內(nèi)皮細(xì)胞的損失，因子觸發(fā)冠狀動(dòng)脈粥樣硬化形成。動(dòng)脈粥樣硬化板塊中脫落細(xì)胞豐富的脂質(zhì)是其核心部分。增強(qiáng)子活性直接被磷酯酰絲氨酸組織因子陽性微粒所支持。巨噬細(xì)胞凋亡構(gòu)成了膜結(jié)合因子的主要來源，平滑肌細(xì)胞也能夠水解。在斑塊重塑的過程中，各種來源的促凝微粒能夠調(diào)節(jié)血管生成，也是斑塊脆弱性的一個(gè)關(guān)鍵因素。促凝微粒，有可能進(jìn)入血栓斑塊后局部血栓吞噬能夠促進(jìn)血管生成，然而促凝微粒能夠加強(qiáng)氧化應(yīng)激導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。此外，促凝微粒活性還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的支持物（NADPH），并且參與活性氧介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞或平滑肌細(xì)胞的凋亡。凋亡的淋巴細(xì)胞源性微粒可以阻止內(nèi)皮源型一氧化碳的合成，這是通過抑制一氧化碳合酶表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的，從而導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。

2.2 免疫介導(dǎo)的血栓性疾病在“免疫介導(dǎo)的后天獲得性血栓性疾病”例如抗磷脂綜合癥和肝素誘導(dǎo)的血小板減少綜合癥，自身抗體可能有助于釋放組織因子陽性微粒，抗磷脂綜合癥的一個(gè)共同特點(diǎn)就高濃度水平的促凝血微粒，現(xiàn)在僅僅在全身性系統(tǒng)紅斑狼瘡患者體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了抗磷脂抗體。系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者的血栓形成傾向與組織因子陽性微粒成很強(qiáng)的正相關(guān)。對(duì)抗磷脂綜合癥患者的血漿樣本化驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其中的內(nèi)皮細(xì)胞具有促進(jìn)組織因子陽性微粒釋放的作用，說明具有抗磷脂抗體的作用。于此相反，平在系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者體內(nèi)微粒的高水與抗磷脂抗體的產(chǎn)生或疾病的演變沒有直接關(guān)系。肝素誘導(dǎo)的血小板減少綜合癥一個(gè)常見的原因是藥物相關(guān)的免疫介導(dǎo)的血小板減少癥，更有害于血栓素的體制的人。肝素誘導(dǎo)的血小板減少癥患者進(jìn)一步促進(jìn)了抗體抗循環(huán)肝素血小板因子-4（PF-4）復(fù)合物，導(dǎo)致血小板活化交聯(lián)。自動(dòng)釋放組織因子陽性微粒暴露適配器，GPIIb IIIa，P-選擇素，血小板和高水平的血栓素發(fā)揮聚集效力從而激活凝血系統(tǒng)。另外，組織因子陽性微粒結(jié)合內(nèi)皮下基質(zhì)，這就進(jìn)一步促進(jìn)更多的血小板復(fù)合物聚集組成組織因子陽性微粒池。

2.3 靜脈血栓性疾病Zwicker發(fā)起一個(gè)隨機(jī)對(duì)照的實(shí)驗(yàn)，評(píng)價(jià)高表達(dá)的組織因子陽性微粒的易栓性，并命名為microTEC研究[17]。癌癥患者但沒有靜脈血栓史接受入組，在4周內(nèi)他們接受一線或二線抗腫瘤治療，對(duì)患者和醫(yī)生采用雙盲法，用抗阻流式測組織因子陽性微粒，組織內(nèi)因子陽性微粒高的被隨機(jī)予以低分子肝素治療，組織因子陽性微粒低的將不予以低分子肝素治療，所有組每2個(gè)月行下肢血管彩超檢查，實(shí)驗(yàn)持續(xù)6個(gè)月，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示血管終末端是典型的血栓，或彩超下是無癥狀的靜脈血栓，這個(gè)實(shí)驗(yàn)證明了組織因子陽性微粒與血栓有一定的關(guān)聯(lián)，但此項(xiàng)研究截止目前結(jié)果還為公布。

3 結(jié)語

血栓性疾病一直是困擾患者及義務(wù)工作者的大難題，近幾年，血栓性疾病患者的入院人數(shù)日趨上升。因此，對(duì)血栓性疾病的病因機(jī)制研究受到廣泛關(guān)注，病因機(jī)制相當(dāng)復(fù)雜，本我概述了最近幾年組織因子陽性微粒對(duì)血栓疾病影響的研究進(jìn)展。綜上所述，他們之間存在一定的聯(lián)系，但還不是很明確。是組織因子陽性微粒促使了血栓的形成，還是血栓性疾病加速組織因子陽性微粒高表達(dá)尚無依據(jù)，所以建立組織因子陽性微粒標(biāo)準(zhǔn)的檢測路徑及指標(biāo)，進(jìn)一步深入研究兩者間的作用有這非常重要的臨床意義。

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