細胞因子誘導的殺傷細胞治療癌癥的基礎與臨床

王志華

1.哈爾濱醫科大學附屬腫瘤醫院，黑龍江哈爾濱 150081；2.合肥鳳凰腫瘤醫院生物免疫治療中心，安徽合肥 230001

過繼性細胞免疫治療（adoptive immunotherapy，AIT）是指通過輸注自身或同種特異性或非特異性“抗腫瘤免疫效應細胞”直接殺傷腫瘤細胞或糾正機體低下的細胞免疫功能來達到治療腫瘤的目的。伴隨細胞生物學，分子免疫學及生物工程技術的發展及相互交叉滲透，細胞介導的過繼免疫治療發展迅速，已成為腫瘤手術、放化療后進行綜合治療的手段之一。有研究人員報道了具有高增殖能力和高細胞毒性的多種細胞因子誘導的殺傷細胞（cytokine-induced kill cell，CIK），由4 種細胞因子活化，具有比淋巴因子激活的殺傷細胞（LAK）細胞更強的腫瘤殺傷活性[1-3]。在血液系統疾病，惡性腫瘤臨床治療中表現出明顯優于其他過繼性免疫治療手段的強大優勢，因而被越來越廣泛地被應用到臨床過繼免疫治療中。目前國內外有關CIK 細胞的研究日趨活躍，筆者僅就近年來國內外CIK 細胞治療惡性腫瘤的基礎和應用研究做以簡要推介，期望對從事此領域的同行有所借鑒及幫助。

1 CIK的表型及膜標志

CIK 細胞主要存在于外周血和肝臟，而以后者分布較多，外周血淋巴細胞中可找到大量的CIK 前體細胞。研究證實，CIK 細胞是一種異質細胞，是一個混合的細胞群體。CD3+CD56+細胞和CD3+CD8+細胞是其主要成分[4]。主要的效應細胞是CD3+CD56+細胞。Negrin等[5]證明誘導擴增出來的CD3+CD56+細胞來源于CD3+CD56 T 細胞，而不是CD3CD56+自然殺傷細胞或體內原來就存在的CD3+CD56+細胞。雖然就單位細胞的細胞毒性而言最強的是CD3CD56+NK 細胞亞群，不過此亞群所占比例小（＜5%），對整體細胞毒性貢獻不大[6]。

研究還發現雖然CD3+CD56+細胞在外周血淋巴細胞中僅含1%～5%，然而該細胞可在一定的培養條件下迅速擴增，一般情況下在有經驗的實驗室體外培養20 d 左右增長數量可達1 000倍以上，而且在回輸體內后在IL-2 存在的情況下仍可進一步增生繁殖。在CIK 細胞的培養過程中，CD3+細胞，即T 細胞得到了優先增生，非T 細胞漸被淘汰。這點可通過流式細胞儀細胞表面標志分析得到驗證。根據上述研究獲得的大量具有活性的CIK 細胞為臨床進行腫瘤免疫治療提供了充足的數量保證。

2 CIK 作用機制

CIK 細胞回輸到患者體內后可特異性地聚集于腫瘤局部發揮抗腫瘤作用。研究發現CD56 抗原可能是CIK 細胞中起增強細胞毒性作用的重要抗原。目前認為CIK 細胞的抗腫瘤作用機制可能有以下幾種：①當CIK 細胞被激活時，通過免疫球蛋白Fc 受體（FcR）使淋巴細胞功能相關抗原-1（LFA-1）和ICAM-1的結合從低親和力轉為高親和力，并向細胞間排出含有氮-甲苯碳酰基-左旋-賴氨酸硫甲苯酯（BLT）的胞漿毒性顆粒[7]，其高表達引發胞漿毒性顆粒依賴性溶細胞作用，致靶細胞死亡。②CIK 細胞也可因表面CD3 受體結合而激活，CD3 與 TCR 或TCRγ 結合，參與信息傳遞，導致胞漿毒性顆粒釋放而產生溶瘤作用。③CIK 細胞自身能分泌白細胞介素2（IL-2）、IL-6、腫瘤壞死因子（TNF）和粒-巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF）等細胞因子，這些因子在較高濃度下可單獨殺傷靶細胞及提高效應細胞毒性[8-9]。④CIK 細胞也可誘導腫瘤細胞凋亡，因CIK 細胞能活化腫瘤細胞凋亡基因[10-11]，使得FLIP、Bcl-2、Bcl-xL、DAD1 和Survivin 基因表達上調。⑤應用氧化酶免疫染色法，發現CD3+CD56+CIK 細胞能分泌穿孔蛋白（PFP），該蛋白與靶細胞溶解有關[12]。CD3+CD56+的雙陽性表達為殺傷功能提供了進一步的物質基礎。

3 用于臨床治療的CIK 細胞來源

CIK 細胞可以來自不同的組織，自體和異體外周血、臍帶血或骨髓等。臨床治療時應根據患者的實際情況選擇合適的采集方法，以獲得最好的治療效果。

3.1 臍血來源的CIK

臍血來源廣泛、采取方便、免疫原性弱，同時富含造血干細胞和單核細胞，而且臍血CD34+細胞較骨髓和外周血CD34+細胞含量更高、更純、具有更強的增殖潛力。使用臍血作為研究對象，結果表明經培養后，臍血單個核細胞迅速擴增，其CD3+CD56+（CIK的主要效應細胞）擴增900倍以上，且CD3+CD8+的Ts 細胞明顯增加，CD3+CD16+CD56+細胞亦明顯增加[13]，這些都說明了臍血可以培養為 CIK 細胞，且擴增潛力極強。該研究還表明臍血CIK 細胞對白血病細胞株及原代白血病細胞有很強的細胞毒活性，其抗瘤作用主要是通過 CD3+CD56+、CD3+CD8+、CD3+CD16+CD56+細胞來實現。臍血CIK 細胞在整個過程中擴增速度都快于外周血CIK 細胞，原因如下：①臍血中CIK 前體細胞含量高；②臍血中的淋巴細胞的絕對值較高，具有較強的增殖潛力[14]；③臍血淋巴細胞對CD3MAb 有較好的反應性，臍血一旦活化能很快產生非特異性NK 細胞樣機制，而且CMNC 比PMNC 更易誘導出CIK 細胞活性，較易溶解腫瘤細胞。臍帶血CIK 前體細胞含量相對較高，因此其殺傷活性高于外周血CIK 細胞[15-17]。綜合上述論點可以認為來源于臍血的CIK 細胞較來源于外周血的CIK 細胞更適合用于臨床治療。

3.2 自體來源的CIK

大量的研究資料表明惡性腫瘤患者存在不同程度的免疫功能受損CD3+、CD4+、CD8+降低。用患者自體的CIK細胞經體外擴增回輸，安全性得到極大提高，避免由于交叉感染引發其他疾病。目前流行的“用自己的細胞治療自己的病”即指的此種方法。患者回輸CIK后外周血免疫標志物 CD3+、CD4+、CD8+、CD3+CD56+均較回輸前大幅上升（平均上升 25%～55%）。

楊琨等[18]用自身CIK 細胞過繼性輸注治療38例腫瘤患者。結果顯示：患者外周血CD3+、CD4+、CD8+T 淋巴細胞都較治療前明顯提高。說明CIK 細胞輸注治療能有效地提高腫瘤患者的細胞免疫功能，并能有效地提高其機體的對腫瘤細胞的殺傷能力。Schmidt-Wolf等[19]應用腫瘤患者的外周血淋巴細胞誘導CIK 細胞，治療期間，血清干擾素（IFN）、GM-CSF 及 TNF水平明顯增加且患者外周血中CD3+淋巴細胞比例增高。

值得提醒的是，在臨床治療需要采集患者自體外周血誘導CIK 細胞時要提前對患者的血液成分、腫瘤大小、臨床分級、生化指標、免疫功能、身體狀態提前進行評估，做到心中有數，對于貧血的患者，要謹慎對待，盡量不采其本人的血，或采血后盡快給予輸血，保證足夠血容量；放化療后的患者要預留充分的恢復期；因貧血或放化療等原因可引起CIK 活化或擴增不佳。懷疑有血行轉移或淋巴管轉移的患者應注意誘導和擴增時間應足夠長（據了解國內有個別單位只培養2～3 d 就回輸的，這是一種極不規范和不負責任的做法，在這么短的時間內CIK 細胞只是對體外環境的適應過程，根本沒有達到真正意義上的擴增），特別回輸前要認真觀察細胞狀態和生長情況，排除有腫瘤細胞混入的可能性，杜絕在回輸時造成人為血行轉移的事故發生。

3.3 骨髓來源的CIK

長期骨髓培養（LTBMC）可選擇性凈化慢性髓性白血病（CML）患者的Ph+前體細胞，同時保留正常造血干/祖細胞。骨髓來源的CIK 細胞增殖能力較外周血來源的CIK 細胞稍差，但在細胞毒方面與外周血CIK 細胞相比無顯著性差異。童春容等[20]提取CML 患者骨髓中的單個核細胞誘導CIK 細胞，觀察CIK 細胞與LTBMC 聯合對患者Ph+細胞的凈化作用，期望建立一種既有體外凈化作用，又有體內抗CML 效應的凈化體系，以克服自體造血干細胞移植容易復發的缺陷。實驗表明CML 患者的骨髓細胞在LTBMC 體系中培養7～9 d后再加入CIK 細胞+IL-2，對CML 患者Ph+細胞的凈化作用明顯比單純LTBMC 強，在統計學上有顯著性差異；從結果來看，CIK 細胞+IL-2 也比LAK 細胞+IL-2或IL-2 活化的骨髓細胞強；CIK 細胞+IL-2 處理共8例，6例患者Ph+在21%以下，其中4例在6%以下、2例為0。Linn等[21]從急性粒細胞白血病采集的骨髓樣本中誘導CIK細胞，結果提示獲得的CIK 細胞在活化、擴增及殺傷靶細胞方面沒有大的影響。

3.4 同種異體來源的CIK

各種致癌因子作用機體使得免疫力下降是導致癌癥發生的原因之一，研究證實腫瘤患者都不同程度地存在免疫耐受的情況。而越是中晚期的患者免疫狀態下降越嚴重。另外術后恢復期和放化療患者其CIK的擴增都相對較差。此種情況下應用同種異體CIK 細胞代替患者自身CIK則成了解決這一問題的途徑之一。有兩點值得注意：一是供者需是來自地方中心血站健康獻血員同型血細胞；二是選用采集時間和儲存時間短，盡可能新鮮的血細胞。本課題組在臨床上遇到必須用同種異體來源CIK的時候往往采集患者直系親屬（父母，兄弟姐妹或子女），同型血的獻血者，因為這樣的獻血者和受者的遺傳指標相對接近，血型相同，相對較為安全可靠。而且無論在活化還是擴增方面比來自患者本身的明顯優越。

綜上所述，前面提及的4 種CIK 都可作為CIK 前體細胞來源進行采集和培養，治療前應根據實驗室的具體情況，培養經驗，特別是受治患者和家屬的意愿選擇適當的采集方式。

4 多種細胞因子在CIK 培養中的作用

4.1 植物血凝素

秦福麗等[22]先用PHA 刺激24 h后再用傳統培養方法繼續培養至15 d 誘導出PHA-CIK 細胞，并將此細胞與自體血漿培養的CIK 細胞加以比較，結果發現各亞群細胞均得到增殖，尤其是CD3+CD8+增殖的最明顯。這可能與PHA選擇性地促進CD3+、CD8+細胞擴增有關。PHA-CIK 細胞中CD3+、CD8+、CD3+CD8+細胞所占的比例大，CD3+CD56+細胞明顯增多（健康人外周血中CD3+CD56+細胞＜1%）。另外，PHA-CIK 細胞對不同的腫瘤細胞的殺傷能力有所不同。這可能與腫瘤細胞的免疫逃避機制不同有關。

4.2 細胞因子對CIK 細胞增殖和殺傷作用的影響

已有的研究均顯示IL-2、IL-7、IL-15對維持殺傷細胞的細胞毒活性起重要作用[23-24]，SCF 可以協同IL-2的細胞增殖作用及增強對IL-2R的刺激效應，而FLT3L 和IL-15協同較單獨應用IL-15 顯著增加來自CD34+細胞的NK 細胞數量，而且可以增加CD34+HSC 上IL-2/IL-15R的表達，Braun等[25]的研究證實培養體系中含SCF 可以增強淋巴因子激活殺傷細胞對急性髓系白血病細胞的殺傷活性。黎陽等[26]在IL-2+IL-7+IL-15組合基礎上分別添加SCF 和SCF+FLT3L，結果顯示單加SCF 會減少CD3+CD56+CIK 細胞產率；聯合使用SCF、FLT3L對同時擴增CD3+CD56+CIK有所幫助，CD3+CD56+CIK 細胞比例及培養體系細胞擴增倍數均顯著增高。因此認為SCF+FLT3L+IL-2+IL-7+IL-15作為臍血-CIK 細胞殺傷誘導體系的細胞因子組合是合適的。最新的研究報道提示IL-15 可有效地擴增培養的CIK細胞，在治療急性髓系白血病和橫紋肌肉瘤方面取得令人鼓舞的效果[27]。

IL-12對 CIK 細胞的促增殖作用略低于IL-2，其誘導產生CD3+CD56+CIK 細胞的能力與IL-2的誘導能力無差別；聯合IL-12 與IL-2 則可以擴增較高比例的CD3+CD56+CIK 細胞，而且CIK 細胞總數也有顯著增高。這說明IL-12 同IL-2 一樣可以誘導CIK 細胞的增殖，而聯合二者有協同作用， 另外用IL-2 和IL-12 共同活化CIK 細胞時適當減少各自的用量亦可減少相應的毒副作用[28]。

4.3 胸腺球蛋白對CIK 細胞擴增的影響

近來，有報道認為胸腺球蛋白（Thymoglobulin，TG；Genzyme，MA，USA），一種通過兔抗人胸腺細胞而獲得的，精制的IgG多克隆抗體，可以取代CD3 單克隆抗體和IFN、IL-2 結合，達到更有效地擴增CIK 細胞的目的。研究者還評估了用TG 活化的CIK 細胞殺傷靶細胞的能力，證明該細胞可更有效地殺傷K562 瘤細胞并能產生大量的具有生物活性的IL-12p40[29]。在誘導CIK 過程中加入IL-24對增殖活性有一定的影響，對細胞表型并無影響但明顯增加了 CIK 細胞的殺傷活性，10∶1、20∶1 和 40∶1 效靶比對腫瘤細胞殺傷率均達到90%以上。這可能與IL-24對腫瘤細胞具有殺傷力而且IL-24 刺激的外周血單個核細胞48 h后有 IL-6、TNF-α 和IFN-γ的高表達，同時 IL-1β、IL-12和GM-CSF 也有一定水平的表達有關[30]。

5 CIK 與樹突狀細胞（DC）細胞共培養

為了提高治療效果，很多實驗室采用DC 和CIK 細胞共同培養，此舉能刺激CIK 細胞毒活性顯著增強[31]。DC 與CIK 細胞共培養后對腫瘤細胞的細胞毒活性增強，混合培養24 h后IL-12的分泌量為CIK 細胞單獨培養時的6.93倍。DC的抗原提呈作用能使CIK 細胞分泌IFN-γ的時間延長，分泌量增加。兩種細胞上清液中 IL-12、IFN-γ分泌量增加，且 CD3+CD8+、CD3+CD56+雙陽性細胞顯著增多[32-33]。過去一段時間國際上把DC 細胞作為腫瘤疫苗的開發研究爭相開展[34]。近兩年以加拿大學者斯坦曼被推薦和獲得諾貝爾醫學獎為契機，國內外以DC 細胞治療腫瘤的臨床實驗逐漸增多起來[35-38]，由此可以預言今后將DC 和CIK 細胞共培養并進行聯合治療將是腫瘤生物治療新的發展目標和發展方向。

6 CIK的臨床應用

6.1 治療方案

參照衛生部《人體細胞治療臨床研究質控要點》和中國免疫學會制訂的《過繼性免疫治療癌癥規范》，其中規定每例患者平均治療2個療程，每個療程回輸細胞總數＞5 ×109個。為保證治療效果，本治療中心實行更為嚴格的質控標準。輸入前3 d 必須進行細菌、真菌和支原體檢測、細胞表型測定、MTT 試驗和體外殺傷活性等測定。活細胞必須占到全部培養細胞的99%（活率）以上，每次輸入細胞數量達到或超過 2 ×109個，每個療程達到或超過（1.0～1.5）×1010個，以此確保治療的安全性及有效性。

6.2 抗腫瘤作用

CIK 細胞對于微小殘留白血病和白血病患者合并丙型肝炎的治療具有良好的療效。德國洪堡（Humboldt）大學的Finke等對10例分別罹患腎癌、結直腸癌、淋巴瘤的晚期腫瘤患者應用IL-2 基因轉染的CIK 細胞，其中3例呈現靜息狀態，1例淋巴瘤患者獲得緩解。另有研究者報道了應用CIK 細胞治療63例腫瘤患者的近期療效，其中肝癌15例，胃癌14例，食管癌11例，肺癌6例，乳腺癌5例，其他腫瘤12例；腫瘤分期為Ⅱ～Ⅳ期，結果顯示CIK 細胞對實體瘤療效顯著，無毒副作用。CIK 細胞對表達Pgp的腫瘤細胞具有有效的殺傷作用，甚至對阿霉素耐藥的K562細胞系比其親代細胞對CIK 細胞更敏感，CIK 細胞的這一特性使其在耐藥腫瘤的治療上具有明顯的優勢。前面提到的TG 活化的CIK 細胞在隨后開展的臨床試驗中治療了5位放化療失敗的成年腫瘤患者，使這幾名患者的生存質量改善，平均生存期相應得到了提高[39]。

意大利學者Sangiolo[40]將2011年以前多家單位的臨床試驗治療數據[41-48]（包括腸癌、腎細胞癌、非小細胞肺癌、胃癌等）進行搜集、匯總，同時將患者疾病進展狀態、CIK 細胞來源、副作用、臨床療效加以比較、分析，對這一療法的臨床作用和有效性給予了充分認可和肯定。

目前國際上對生物治療的作用和療效已得到相當認可，各地區、各國家之間的協作和交流日益增加，CIK 治療國際網站（International Registry on CIK Cells，IRCC）定期發布的信息將使我們可以隨時、隨地了解世界各國 CIK 細胞治療的動態及進展。

6.3 療效評估

近年來，應用CIK 細胞進行實體瘤治療的臨床試驗在國內外陸續開展，CIK 可作為單獨的治療方法，也可和外科手術，放療，化療進行綜合治療，還可作為個體化治療和其他療法（如中醫中藥）結合起來。經驗提示在治療時選擇腫瘤負荷相對較小的患者，可以起到減輕癥狀（包括血液、生化指標、腫瘤標志物等），增加體力，提高免疫能力（CD3、CD4、CD8、CD56等免疫細胞比值和數量的增加），減少腫瘤負荷。回輸相對較多的CIK 細胞，或增加回輸數量和次數，即提高效靶比例可以使療效適當提高。中晚期患者減輕臨床癥狀，提高生存質量，延長生存期或長期帶瘤生存同樣是我們關注的目標。

6.4 心理護理

較之手術，放化療所謂的經典治療和上世紀末LAK、TIL 過繼免疫療法，CIK是一種新的腫瘤生物治療方法，因為開展的單位相對不多，好多患者包括某些醫院或科室的醫生對此療法也知之甚少，有人只是偶爾接觸或道聽途說，知其然不知所以然，甚或抵觸、非難者也兼而有之。因此接診時要耐心細致地向患者及家屬介紹CIK的概念、方法、療效、可能出現的副作用等。回輸時最好安排醫護人員在現場，一旦出現問題，可對癥處理，及時解決[49]，消除其疑慮及恐懼心理。

6.5 副作用及對策

CIK 細胞臨床應用時的副作用主要包括：輕度發熱、畏寒、疲乏等，個別人偶見關節痛、腹痛等。一般表現為類感冒癥狀，這些癥狀主要和IL-2的副作用相關聯，均較輕微而且可以自行緩解。一般發熱都在38℃以下，可不用處置，但如患者在輸注過程中體溫超過39℃，應立即停止治療，尋找原因并及時處理，通常給予解熱鎮痛劑對癥治療。根據國內外不同實驗室的報道發熱的患者占總體治療人數的3%～30%，在治療中遇見的發熱患者比例尚不足1%，應該說嚴格的操作管理，合理的治療流程以及到位的質控措施是不可或缺的。

7 回顧與展望

近年來CIK 細胞在基礎和臨床研究兩方面都取得了長足的進步，成為新一代腫瘤過繼免疫治療的主力軍，是目前及將來生物學領域研究熱點之一。目前，在美歐、亞洲、大洋洲的十幾個國家都已經進入臨床試驗治療。縱觀國內，特別是近幾年來已有數百家醫院及科研院所相繼申請或開展，發展勢頭較好，這首先得益于衛生部將體細胞治療列為第三類臨床技術的國家政策，其次中國人口眾多，腫瘤的發病例也持續居高不下。但在CIK 臨床治療逐漸市場化的發展過程中也不可避免地存在許多問題有待解決，今后應在以下方面引起注意并需進一步付諸努力：①擴大宣傳力度，增加社會公眾對CIK 治療的認知和了解，這不僅是從事此工作醫護人員份內的事也是醫療行政和監管部門的責任和義務。②加強申報、審批、指導及監管制度，在積極推進第三類臨床技術準入的同時，堅持條件，嚴格把關。切實管理好醫療市場。同時降低各級醫療單位的收費標準或提高報銷比例，在此基礎上擴大治療樣本更多的讓事實說話，讓更多的腫瘤患者受益。③精心設計，精心管理，精心治療，設立嚴格的對照，盡量不出紕漏和醫療差錯，拿出令人信服的證據和經得起推敲的科學結論。④建立CIK 細胞過繼免疫治療的統一方案和標準的治療流程，尋找細胞因子聯合應用的最好組合，制訂個體化治療方案，提高針對性及有效性。⑤CIK 細胞治療在嚴格質量控制，合理應用劑量、回輸途徑及臨床護理等方面亦需要更加深入的探索和研究，適時建立培訓、檢查、監督體系，對于保證不了治療質量的單位限期整改或予以注銷治療資格，防止因經濟利益化驅使而將治療引入歧途。⑥提升治療水平，增加科技含量。意大利和法國學者Virna、Heleue等人將編碼抗CD33-C 和抗CD33-CCD28-OX40-C 受體基因的SFC 逆轉錄病毒載體導入CIK 細胞，結果顯示轉基因細胞極大地改善了抗白血病活性，提示此種細胞可提供最佳的殺傷活性，對不同來源的急性髓性白血病細胞的殺傷活性提高到了80%，并成功釋放高水平的細胞活性因子[50]。Sheen 治療組嘗試將患者的T 細胞導入抗CEA受體抗體，成功地誘發T 細胞活化以對抗自體腫瘤細胞[51]，與此相關聯的研究將CD28 和CD3ζ信號區域（signalling domains）基因重組的BW431/26-scFv-Fc-CD28-ζ受體導入T 細胞，或將腫瘤抗原、T 細胞受體、配體或單克隆抗體等通過基因工程的方式轉導給CIK 細胞，以加強其趨化性，提高特異性，解除對腫瘤細胞的免疫耐受[42，52-56]，這些新治療元素的引進以及新方法、新措施的創建無疑將給腫瘤生物治療帶來新的勃勃生機。

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