原發性高血壓條件下骨髓來源內皮祖細胞數量及功能的變化

陸慶明 邸春霞 張榮慶 王海昌

1.解放軍總醫院南樓外一科，北京 100853；2.解放軍第三〇九醫院心內科，北京 100094；3.第四軍醫大學西京醫院心內科，陜西西安 710032

內皮祖細胞（endothelial progenitor cells，EPC）是血管內皮細胞的前體細胞，亦稱為成血管細胞，即具有向成熟內皮細胞分化的潛能，EPC 主要存在于骨髓、外周血、臍血等，在胚胎期參與胚胎血管生成，出生后的參與血管新生過程，其數量及功能變化直接影響到心血管系統的自我修復能力[1]。而且近年來的研究發現，EPC 可以作為內皮損傷的標志物，EPC 數量減少可以作為心血管事件獨立的危險因素[2]。本研究擬在探討高血壓條件下EPC 數量及功能的變化，為闡明原發性高血壓及其血管并發癥發病機制提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗分組

將12只雄性自發性高血壓大鼠（SHR）分為6周齡組和12周齡組，每組各6只，以同周齡正常雄性Wistar-Kyoto（WKY）大鼠（10只）分別為對照組，每組各 5只，均購自第四軍醫大學動物實驗中心，以RBP-1B型大鼠血壓計（中日友好臨床醫學研究所）連續測壓3次大鼠尾動脈收縮壓取均值。

1.2 主要試劑

VEGF（Biovision 公司），M199 培養基（Gibco公司），b-FGF（Peprotech 公司），胎牛血清（Hyclone 公司），FITC-UEA-1（Sigma 公司），Dil-ac-LDL（Invitrogen 公司），NO 檢測試劑盒（南京建成生物工程公司）。

1.3 EPC的分離與培養

頸椎脫臼法處死實驗大鼠，取雙側股骨、脛骨、肱骨，去除兩端軟骨后以完全培養液反復沖洗骨髓腔，將得到的骨髓細胞懸液與淋巴細胞分離液以1∶1 比例混合后采用密度梯度離心法獲取單個核細胞，將單個核細胞接種于M199培養基（M199，VEGF 10 μg/L，bFGF 5 μg/L，10%FBS，L-谷氨酰胺 300 mg/L，青霉素 100 U/mL，鏈霉素 100 μg/mL），4 h后翻轉培養瓶去除貼壁細胞，未貼壁細胞繼續培養促其二次貼壁，繼續培養7d后消化收集二次貼壁細胞接種于96 孔板中，將得到的細胞進行細胞化學分析。

1.4 細胞染色鑒定

細胞與 Dil-ac-LDL（10 μg/mL）在 37℃避光孵育 10 h，中性甲醛（2%）固定10 min，以PBS 液漂洗后加入FITCUEA-1（10 μg/mL），避光孵育 1 h。用多波長激光共聚焦顯微鏡觀察Dil-ac-LDL 與FITC-UEA-1 雙染陽性細胞被認為是正在分化的EPC。隨機選擇15 孔并在倒置熒光顯微鏡下（200倍視野）計數EPC。

1.5 EPC 增殖能力檢測

7d后消化收集二次貼壁細胞以1.0 ×104 細胞/孔的密度接種于96 孔板中，每孔加入10 μL MTT（5 mg/mL）溶液，繼續孵育4 h，每孔加入二甲基亞砜150 μL。微量震蕩器充分震蕩10 min后，在酶聯免疫檢測儀測吸光度值（波長 490 nm）。

1.6 NO分泌能力檢測

消化培養7d的細胞，離心后加入完全培養液重懸，將細胞接種于96 孔板，接種密度為1.0 ×104 細胞/孔。將孔內培養液上清收集后用硝酸還原酶法測定檢測各孔上清和濃度之和從而間接反映NO 含量。

1.7 凋亡檢測

消化培養7d的細胞，離心后加入完全培養液重懸，以1 000 r/min 離心5 min后棄上清，流式細胞儀檢測細胞凋亡比例。

1.8 統計學方法

采用SPSS 10.0 軟件進行方差齊性檢驗，計量資料數據以均數±標準差（±s）表示，比較采用成組t檢驗，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 血壓

SHR 6周齡組平均血壓124.5～126.0 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa），WKY 6 周齡組平均血壓 114.8～116.5 mm Hg（P ＜0.05）；SHR 12 周齡組平均血壓 140.5～146.0 mm Hg，WKY 12周齡組平均血壓 117.8～120.4 mm Hg（P＜0.01）。

2.2 EPC的分離與鑒定

鏡下觀察分離得到的單個核細胞經過7d 誘導分化為梭形或多角形的內皮樣細胞，多波長激光共聚焦顯微鏡下以雙染法（Dil-ac-LDL 與 FITC-UEA-1）鑒定培養細胞，Dil-ac-LDL 染色陽性細胞在顯微鏡下激發出紅色熒光，而FITC-UEA-1 染色陽性細胞呈綠色熒光，而雙染陽性細胞即為正在分化的EPC 細胞。培養細胞計數結果：SHR 6周齡組 EPC 數量[（38.7±4.3）個/視野（×200）]與對照組[（44.7±5.2）個/視野（×200）]相比差異無統計學意義（P＞0.05）。SHR 12周齡組 EPC 數量與對照組相比[（10.7±1.6）和（49.1±9.2）個EPC/視野（×200）]明顯減少（P＜0.01）。

2.3 原發性高血壓對EPC 增殖能力的影響

與對照組相比，SHR 6周齡組EPC 增殖能力略低 [吸光度值（0.174±0.009）和（0.213±0.012）]（P＜0.05）；SHR 12周齡組EPC 增殖能力較對照組明顯降低 [吸光度值（0.121±0.006）和（0.209±0.022）]（P＜0.05）。

2.4 原發性高血壓對EPC NO分泌的影響

SHR 6周齡組NO分泌較WKY 6周齡組減少 [（44.6±5.3）μmol/L 和（56.3 ±4.5）μmol/L]，（P＜0.05），SHR 12 周齡組NO分泌與對照組相比顯著下降[（37.5±1.4）μmol/L 和對照組（50.6±2.3）μmol/L]（P＜0.01）。

2.5 原發性高血壓對EPC 凋亡的影響

SHR 6周齡組EPC 凋亡率與WKY 6周齡組相比差異無統計學意義 [（13.3±2.0）%和（11.7±0.2）%]（P＞0.05），SHR 12周齡組EPC 凋亡率與對照組相比顯著增加[（34.5±2.1）%和（10.7±0.4）%]（P＜0.01）。

3 討論

高血壓并發癥主要為心、腦、腎、大血管及眼底病變，其原因可分為“血壓升高因素”和“動脈粥樣硬化因素”。前者可通過降低血壓水平而有效預防，而高血壓作為動脈粥樣硬化最重要的獨立危險因素，降低血壓本身不能阻止動脈粥樣硬化的進程，血壓升高引起的內皮細胞損害在其中起了重要的作用，啟動動脈粥樣硬化一系列反應鏈。最初人們認為當血管內皮損傷后，臨近損傷部位的健康內皮細胞遷移、增殖是主要的修復途徑。有學者從人外周血發現循環內皮祖細胞，并在動物模型中發現EPC 能分化為成熟內皮細胞[3]，后來的研究者在外周血、脾臟、骨髓、臍血中都分離出了EPC，并證實了EPC 有很高的增殖能力且能在VEGF、SDF-1等趨化因子的作用下歸巢到缺血組織參與新生血管形成[4]。EPC 在治療動脈粥樣硬化性疾病和外周血管病的巨大的潛力使其成為近年來研究的熱點。

既往對EPC 活性及分布的研究表明，EPC 在胚胎期分布在配外中胚層卵黃囊血島，在成年個體中，EPC 在骨髓來源的單個核細胞中約占3%，在外周血單個核細胞中約占0.2%。心血管危險因素與外周血EPC的數量、遷移功能呈顯著負相關[5]，國內研究證實了患有冠心病的患者外周血EPC的數量減少，功能減退[6]。但上述研究均是抽取冠心病患者外周血，分離EPC 計數并檢測其功能，關于高血壓患者與EPC的研究較少，高血壓患者其骨髓來源EPC的數量和功能變化如何仍未有定論。

本研究的結果提示在高血壓條件下，骨髓來源EPC的數量減少，在SHR 6周齡組與對照組相比這種差異不明顯（P＞0.05），但隨著血壓增高及高血壓病程的延長，骨髓來源EPC 數量顯著減少（P＜0.01）。SHR 6周齡組骨髓來源EPC 與對照組比較增殖能力、NO分泌能力均減退（均P＜0.05），細胞凋亡與對照組比較差異無統計學意義（P＞0.05）；12周齡SHR 骨髓來源EPC 與對照組比較EPC 增殖能力、NO分泌功能均明顯受損（均P＜0.01），細胞凋亡增多（P＜0.05）。說明隨著高血壓病程的發展骨髓來源EPC 功能逐漸受到損害，凋亡增多。

綜上所述，本研究證實了高血壓條件下骨髓來源EPC數量減少，功能減退，凋亡增多，且隨著血壓升高和高血壓病程的發展，高血壓對EPC的損害逐漸加重。為解釋高血壓血管并發癥的發生機制提供了實驗依據，為進一步了解EPC的生物活性和調節機制打下基礎。

[1]Werner N，Nickenig G.Clinical and therapeutical implication of EPC biology in atherosclerosis[J].J Cell Mol Med，2006，10（2）：318-332.

[2]Hill JM，Zalos G，Halcox JP，et al.Circulating endothelial p rogenitor cells，vascular function，and cardiovascular risk [J].N Engl J Med，2003，348（7）： 593-600.

[3]Gensch C，Clever YP，Werner C，et al.The PPAR-gamma agonist pioglitazone increases neoangiogenesis and prevents apoptosis of endothelial progenitor cells.Atherosclerosis，2006，（192）：67-74.

[4]Shirota T，He H，Yasui H，et al．Human endothdial progenitor cel1-seeded hybrid graft：proliferative and antithrombogenic potentials in vitro and fabrication processing[J].Tissue Eng，2003，9（1）：127-136.

[5]Vasa M，Fichtlscherer S，Aicher A，et al.Number and migratory activity of circulating endothelial progenitor cells inversely correlate with risk factors for coronary artery disease[J].Circ Res，2001，89（1）：1-7.

[6]劉燕榮，陳君柱，王興祥，等.冠心病患者外周血內皮祖細胞數量和功能的變化[J].臨床心血管病雜志，2004，3（20）：145-147.