基于PCR技術的現代分子生物學操作在中藥鑒定中的應用

詹立平 趙 鑫 劉志梅

1.遼寧衛生職業技術學院藥學系，遼寧沈陽 110101；2.遼寧林業職業技術學院高職教育研究所，遼寧沈陽 110101

我國勞動人民幾千年來在與疾病作斗爭的過程中，通過實踐，逐漸積累了豐富的醫藥知識。千百年來，中藥在維系國人的身體健康方面發揮了不可替代的作用。中藥包括植物藥、動物藥和礦物藥，品種繁多，加之各地的用藥品種和用藥習慣不盡相同，同名異物和同物異名現象屢見不鮮。為規范藥材市場、鑒定中藥真偽優劣，確保中藥的質量與療效，建立一套準確、簡捷、迅速的鑒定方法迫在眉睫。

近年來分子生物學的發展突飛猛進，特別是聚合酶鏈式反應（PCR）技術的問世，推動分子生物學的各個領域向縱深發展[1]。基于PCR技術的現代分子生物學操作在中藥鑒定中得到應用，以其獨具的準確性和可靠性，彌補了傳統中藥鑒定中的許多不足，展現出其他方法難以比擬的優勢。

本文以PCR技術為切入點，著重介紹目前在中藥鑒定中運用較多的幾種分子生物學操作技術，希望能夠拋磚引玉，合眾人之力增加中藥鑒定中的現代元素，推動中藥鑒定方法的改進與革新。

1 PCR技術概述

PCR技術由美國Karray等學者于1985年首創， 并由美國Cetus公司開發研制。PCR技術原理是根據已知DNA片段序列，人工合成與該DNA 兩條鏈末端互補的寡核苷酸引物，在酶促作用下將待檢DNA 序列進行體外擴增。

PCR 反應體系基本成分包括模板DNA（待擴增DNA）、引物、4 種脫氧核苷酸（dNTPs）、DNA 聚合酶和適宜的緩沖液。類似于DNA的體內復制過程，PCR 反應的特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。

PCR 由變性-退火-延伸三個基本反應步驟構成：①變性：模板DNA 經加熱至93℃左右一定時間后，雙鏈DNA解離為單鏈；②退火：模板DNA 經加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA 單鏈的互補序列配對結合；③延伸：DNA 模板與引物的結合物在TaqDNA 聚合酶的作用下，以dNTP 為反應原料，靶序列為模板，按堿基配對原則，合成一條新的與模板DNA 鏈互補的半保留復制鏈。重復上述反應步驟，就可獲得更多的“半保留復制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環的模板。如此循環往復，在短短的幾個小時的時間里，模版DNA 鏈便可被擴增幾百萬倍。

PCR技術使人們能夠在體外進行DNA的復制，它的意義在于DNA是遺傳密碼的載體，具有相對的遺傳穩定性，每種生物都有其固定的遺傳密碼。只要得到某種物質的微量細胞并將其細胞內的遺傳物質提取出來，再通過PCR技術將其擴增，就會準確無誤地判斷該物質，進而判斷該物種。PCR技術以其獨具的可靠性和準確性，在中藥材基原鑒定和真偽鑒別方面擁有廣闊的應用空間。

2 基于PCR技術的現代分子生物學技術

PCR技術是現代分子生物學的基石，該項技術的問世具有劃時代的意義。以PCR技術為基礎，分子生物學領域衍生出多種新的實驗操作技術，在生命科學的各個領域均得到廣泛的應用。本文僅對應用于中藥鑒定過程的幾種操作技術進行介紹。

2.1 RAPD 技術

RAPD 即隨機擴增多態性DNA，該技術建立在PCR技術基礎之上，可對整個未知序列的基因進行多態性分析操作。RAPD 技術以基因組DNA 為模板，以單個人工合成的隨機多態核苷酸序列為引物，在熱穩定的DNA 聚合酶（Taq 酶）作用下，進行PCR 擴增。擴增產物經電泳、染色后，在紫外透視儀上檢測多態性。擴增產物的多態性反映了基因組的多態性。

目前，RAPD 技術已應用于中藥材的種質鑒定及偽品鑒別等方面。徐鵬等[2]運用RAPD 技術對廣西鉤藤屬藥用植物進行遺傳多態性分析，獲得多態性條帶231 條，多態率達到88.9%。結果表明，3 種廣西鉤藤屬藥用植物的聚類結果與其地理分布一致，所得RAPD 標記可用于鉤藤屬藥用植物的多態性研究；李雄英等[3]運用RAPD 技術對絞股藍及其偽品進行DNA 指紋圖譜的鑒別研究，實驗結果證實該技術可有效地鑒別絞股藍及其偽品烏蘞莓。

2.2 ISSR-PCR技術

簡單序列重復區間（inter-simple sequence repeats，ISSR）是近年來發展起來的一類新型的分子標記技術，具有多態性高和重復性好等優點，已廣泛用于藥用植物的鑒定和遺傳多樣性研究[4]。柴素芬等[5]以象頭山蕓香科植物為研究對象，從DNA 提取、退火溫度、循環次數、引物篩選等方面研究ISSR 反應及優化條件，建立和優化蕓香科藥用植物的ISSR 反應體系。結果表明，ISSR 技術適合于蕓香科藥用植物的品種鑒定，同時可為蕓香科藥用植物的資源評價提供依據。

2.3 PCR 擴增的特定片段的限制性位點分析

限制性片段長度多態性 （restriction fragment length polymorphism，RFLP）利用放射性標記的探針，通過雜交顯示特定的基因組DNA 酶切片段，從而構建多態性的DNA圖譜。它代表的是基因組DNA 在限制性內切酶消化后產生的片段在長度上的差異。

PCR-RFLP 技術綜合RFLP 技術與PCR技術二者的優勢，用特異性的引物先對模板DNA 進行擴增，獲得特異性的擴增產物，之后利用多種不同的限制性內切酶對擴增產物進行酶解，構建物理圖譜，分析限制性位點在分類群中的差異。該方法準確可靠，重復性好，在中藥鑒定研究中有一定的應用報道。吳平等[6]從5 種海馬干標本中提取DNA，利用PCR技術擴增12SrRNA 和細胞色素b 基因片段，對擴增產物進行RFLP分析。實驗結果證實，采用PCR-RFLP技術可鑒別出其中的兩種海馬。

2.4 mRNA 差異顯示技術

mRNA 差異顯示技術通過將總RNA 反轉錄成單鏈cDNA，然后進行PCR 擴增，由此分離出不同分子大小的DNA，選擇有差異表達的基因進行序列分析。該技術具有快速、多功能、所需RNA 量少和重復性高等優點而被廣泛用于分離克隆真核生物差異表達的基因[7]。目前，該技術在藥學領域中的應用僅處于起步狀態，借助該技術可以將栽培品種與野生種、道地藥材與普通藥材之間的差異鑒別出來。因此，mRNA 差異顯示技術在中藥材的質量鑒定方面將擁有廣闊的應用空間。

2.5 基因測序

基因測序是對藥材特定的基因片段進行精確的DNA序列分析，并加以比較，從而達到鑒別藥材的目的。常用的基因片段包括線粒體細胞色素基因和rRNA 基因等。用于基因測序的基因在種內高度保守，而在種間序列的差異較大，適用于中藥材種間的鑒定。

徐麗等[8]從冬蟲夏草與其他品系蟲草及其混淆品蟲草中提取DNA，對核糖體基因（rDNA）進行測序，設計18S 基因特異性引物進行擴增，擴增產物經純化后，直接測序。結果表明，冬蟲夏草與西藏白草、西藏黑草、無頭草、默勒草的18 S 序列相似度為100%；與亞香棒、北蟲草的18S 序列相似度分別為91.37%和91.74%。由此可見，18S 序列可有效地鑒別冬蟲夏草及其混淆品北蟲草和亞香棒蟲草。此外，基因測序技術也被報道應用于三七[9]及其偽品的遺傳背景差異分析、巴戟天[10]道地性研究及半夏[11]的基原鑒別。

2.6 基因芯片

基因芯片又稱DNA 芯片，是專門用于核酸檢測的生物芯片。基因芯片的主要技術流程為：芯片的制備→樣品的制備→雜交反應→芯片信號的檢測與分析→芯片數據的統計分析和生物學分析。即在固相載體上按照特定的排列方式固定大量序列已知的DNA 片段，將樣品基因組DNA 或RNA 經過PCR 或RT-PCR 擴增等技術摻入標記分子后，與已知序列雜交，通過熒光檢測系統對芯片進行掃描，檢測雜交信號強度，利用計算機軟件進行數據分析后，即可獲得樣品中大量的基因序列特征或基因表達特征信息。基因芯片技術可為植物種屬的驗證與質量控制提供一種快速、高質量的檢測工具。楊忠等[12]利用基因芯片技術對多種貝母根莖的基因組DNA 進行操作，結果顯示不同貝母種屬可在芯片不同位置檢測到熒光信號，從而提供了一種快速高效的集基因分型與中藥鑒別于一體的方法。

3 展望

與傳統的中藥鑒別方法相比，基于PCR技術的分子生物學鑒定技術具有準確性高、重現性好、穩定、可靠的優點。利用現代化分析技術可準確鑒別中藥的真偽，從而完善中藥質量評價體系，保證中藥安全、有效、可控。目前，最重要的是要充分了解各項技術的優勢，以便取長補短、綜合利用，滿足市場對藥材準確鑒定的需求。

[1]金宇良.PCR技術的研究進展[J].現代農業科技，2012，10：47-48.

[2]徐鵬，吳耀生，黃瑞松，等.3 種廣西鉤藤屬藥用植物的RAPD多態性分析[J].時珍國醫國藥，2012，23（3）：702-705.

[3]李雄英，羅育，吳耀生，等.RAPD 技術在藥用植物絞股藍鑒別中的初步研究[J].武漢植物學研究，2008，26（3）：251-254.

[4]關萍，馬丹煒，王貴俠，等.利用ISSR 標記對天麻的貴州種群遺傳多樣性分析[J].北京林業大學學報，2007，29（6）：35-40.

[5]柴素芬，陳兆貴，洪彩霞，等.蕓香科藥用植物ISSR-PCR 反應體系的建立及優化[J].安徽農業科學，2008，36（33）：14433-14435，14512.

[6]吳平，周開亞，張朝暉，等.海馬類藥材的分子遺傳標記鑒定研究[J].藥學學報，1998，33（3）：226.

[7]王新超，梅菊芬，楊亞軍.mRNA 差異顯示技術在植物學領域的應用[J].浙江農業學報，2008，20（2）：144-148.

[8]徐麗，王小平，張雪峰.冬蟲夏草與其他品系蟲草及其混偽品的18Sr-RNA 基因測序鑒別研究[J].中國醫藥指南，2012，10（12）：413-415.

[9]張英，黃明輝，柏干榮，等.三七的18SrRNA，matK 基因序列和HPLC化學指紋圖譜分析研究[J].藥品評價，2005，2（1）：23-29.

[10]丁平，劉瑾，邱金英，等.基于核糖體rDNAITS 序列變異探討巴戟天道地性[J].藥學學報，2012，47（4）：535-540.

[11]劉玉萍，曹暉，王孝濤.基因測序技術在中藥質量研究中的應用（Ⅰ）山東鄆城猴頭半夏基原的DNA 測序鑒別[J].藥物分析雜志，2001，21（6）：423-424.

[12]楊忠，張亞歐，黃文秀，等.基因組學與生物芯片技術在中藥研究與開發中的應用[J].藥學學報，2002，37（6）：490.