血清蛋白醋酸纖維薄膜電泳實驗影響因素分析及改進

于樂軍 劉晨光

中國海洋大學海洋生命學院 山東青島 266001

血清蛋白醋酸纖維薄膜電泳實驗影響因素分析及改進

于樂軍 劉晨光

中國海洋大學海洋生命學院 山東青島 266001

血清蛋白醋酸纖維薄膜電泳實驗是高校生物化學實驗必開實驗項目之一，但實驗影響因素較多。針對影響實驗的各種可能因素進行分析并提出相應改進對策，以期為提高本實驗的成功率提供一些可供借鑒的經驗。

血清蛋白；醋酸纖維薄膜；實驗儀器

10.3969/j.issn.1671-489X.2013.12.132

作者：于樂軍，工程師，碩士，主要研究方向為生化與生物材料。

血清蛋白醋酸纖維素薄膜電泳法是以醋酸纖維薄膜為支持物，利用血清中含有白蛋白、α-球蛋白、β-球蛋白、?-球蛋白等各種蛋白質的氨基酸組分、立體構象、相對分子質量和等電點不同，在電場中的移動速率不同，通過電泳分離的一種方法[1]。因為其具有微量、快速、簡便、分離清晰、對樣品無吸附現象等優點，成為生物化學實驗課必開的實驗項目之一。但在實際的操作中，影響實驗的因素較多，除了電場強度、溶液的pH值、溶液的離子強度、電滲現象等因素外，實驗課課前準備工作是否到位以及實驗過程中學生的實驗操作水平也直接影響實驗結果的準確性和完整性。筆者結合多年實驗教學經驗和他人研究工作，對整個實驗操作過程中需要注意和改進的地方進行闡明，期望為提高實驗的成功率提供一些可供借鑒的經驗。

1 實驗課課前準備

1.1 實驗材料

1）血清。本實驗室一直以小牛血清代替人血清用于實驗課程的教學，取得較好的實驗效果。且有研究證實[2]，牛血清代替人血清進行醋酸纖維素薄膜電泳，其結果與人血清蛋白醋酸纖維素薄膜電泳結果相近，實驗穩定，重復性好。小牛血清相較于寶貴的人血清，較易獲得且儲存穩定，組分純凈，沒有其他雜質干擾，為實驗結果的準確性提供了很好的保證，用于實驗課教學完全可以達到預期的實驗目的和要求。

實驗用血清標樣的質量問題是直接影響電泳結果的關鍵要素[3]。用不新鮮或溶血血清標樣進行電泳，容易造成電泳圖譜區帶不清晰，更有甚者會出現拖尾現象。因此，血清應采用清澈透亮且無溶血現象的標樣，且解凍后的血清必須置于冰箱4 ℃冷藏儲存，每次實驗前需仔細觀察，如出現渾濁或溶血現象要及時更換，保證血清的新鮮。

2）醋酸纖維素薄膜。醋酸纖維素薄膜的質量對電泳的結果有很大的影響。薄膜厚薄質地均勻，無光澤面（糙面）微孔均勻，在電泳時跑出的區帶均勻；相反，質地不均勻，無光澤面（糙面）微孔不均勻，在電泳時會造成區帶不清晰，蛋白質在白色斑點處不泳動的現象，影響電泳圖譜的完整性。因此，電泳時要選擇厚薄質地比較均勻的薄膜進行電泳，其辨別方法是：用鑷子取干薄膜輕放在電極緩沖液的表面，如薄膜迅速濕潤，且整條色澤深淺一致，則表明此薄膜質地均勻；如薄膜表面出現深淺不一的條紋或斑點等，則表明此薄膜質地不均，應舍棄不用[4]。

1.2 實驗儀器

1）電泳儀電源。應選擇電壓、電流等各項性能指標均穩定的電泳儀電源。筆者曾用即將淘汰的不穩定電泳儀電源進行電泳實驗，所得到的電泳圖譜區帶分離不清，容易出現拖尾及跑偏等現象，嚴重影響實驗結果的準確性。

2）電泳槽。電泳槽準備時，要首先檢查槽中鉑金絲連線是否正常連接正負極插口。若掉線，電泳時會造成蛋白質不泳動，無法跑出相應的區帶。制作電泳槽上的濾紙橋要根據膜支架的長度和高度裁剪大小合適的濾紙，一般要采用雙層濾紙橋。另外，將濾紙橋用緩沖液濕潤后，要用玻璃棒輕輕朝一個方向擠壓，趕掉里面的氣泡，使濾紙緊貼在膜支架上。整個實驗期間，盛有電極緩沖液的電泳槽應處于封閉狀態，以防緩沖液的蒸發改變其pH值及離子強度，對實驗結果造成影響。

3）點樣器。實驗教材[1]選用載玻片作為點樣器，由于其長端截面較厚，且玻片寬度稍比薄膜寬，點樣時容易使血清過多，橫跨薄膜，最終導致電泳后電泳圖譜蛋白質分離不均，有明顯的邊緣效應，且易產生拖尾現象。因此，實驗室選用小巧的蓋玻片作為點樣工具，其端面佷薄，容易切割，點樣時較易形成細條帶，增加電泳的成功率。

1.3 實驗試劑

1）電極緩沖液。應根據所測樣品理化性質，從縮減電泳時間和提高圖譜分辨率出發選擇緩沖液的種類、離子強度和pH。血清蛋白纖維素薄膜電泳可選用pH8.6，離子強度在0.06～0.09之間的巴比妥緩沖液或硼酸緩沖液，這兩種緩沖液共有的優點是具有強揮發性，對顯色和紫外光等觀察區帶無影響。另外，用硼酸緩沖液作為電極緩沖液進行電泳，具有使電泳圖譜更清晰完整、無毒副作用、費用低、使用時效長等優點[5-6]，其取代傳統的巴比妥緩沖液必將成為一種趨勢。

緩沖液配制時，為保證其離子強度和pH，應用電子分析天平精確（0.001 g）稱量，定容后再用pH計校正。

2) 染色液。染色液選擇的一般原則是染料對被分離樣品有較強的著色力，水溶性好、穩定、吸光度敏感，形成的染料蛋白質復合物穩定，且易洗脫比色[7]。實驗通常選擇較易脫色的氨基黑10B作為染料，也可選擇麗春紅等。

3) 漂洗液。漂洗液由于用的是易揮發的乙醇和乙酸作為主要原料，所以一般臨用時配制或配好后密閉，防止其揮發，影響漂洗效果。

2 實驗實施過程

2.1 薄膜的準備

用鑷子夾取薄膜，分辨其無光澤面（糙面），無光澤面（糙面）向下一條一條放入盛有電極緩沖液的培養皿或大燒杯中，用鑷子輕輕地壓薄膜的表面，使其完全浸泡在電極緩沖液中，浸泡時間不少于30 min。如時間過短，則不能保證膜片上有一定量的緩沖液，難以使其恢復原來多孔的網狀結構[2]。禁止一次夾取多條薄膜一起放入電極緩沖液中，這樣容易造成浸泡不均勻狀況，影響電泳的效果。

將浸泡好的薄膜用鑷子取出，放在濾紙上，輕輕吸取多余的水分，這個過程以薄膜“不干不濕”為標準。若吸得過干，電泳時電流無法通過，蛋白質不泳動，無法得到正確的圖譜；若吸后薄膜較濕，點樣時血清易擴散，點樣線過寬，得到的電泳圖譜蛋白分離不開，且容易連成一片，影響結果觀察。

另外，實驗操作中嚴禁用手去觸碰薄膜，以免沾污薄膜，影響實驗的準確性。

2.2 點樣

將吸去緩沖液的薄膜在日光燈下分辨其無光澤面（糙面）后，無光澤面（糙面）向上，放在載玻片上，保證薄膜的平穩性，以備點樣。點樣是整個實驗的關鍵所在，它直接影響到電泳后圖譜的完整性和準確性。因此，點樣前應讓學生用蓋玻片沾取血清在濾紙上反復練習幾次，直到掌握了點樣技術，有把握后，再正式在薄膜上點樣。

正式點樣，用玻璃棒沾取血清，均勻地涂在蓋玻片的端面上，以“印章法”垂直地點在薄膜無光澤面（糙面）一端1.5～2 cm處，使樣品成一條狀涂于薄膜上。點樣時，應做到輕、穩、準。點樣的量最好能控制在1 ul/cm，相當于60～80 μg[8]。點樣過少，電泳后顯色不清晰；過多，則不易分離且容易拖尾。

2.3 上樣

用鑷子夾取點好樣的薄膜搭于電泳槽內雙層濾紙橋上，稱為上樣。上樣時應注意：1）點樣端要位于電泳槽的負（陰）極；2）無光澤面（糙面）向下；3）點樣線要懸空，離雙層濾紙橋有一定的距離，不能貼于濾紙橋上；4）薄膜要拉直，中間不能有彎曲；5）薄膜要緊貼于濾紙橋上，中間不能有氣泡；6）相鄰薄膜間不能靠得太近，要留有2～5 mm左右的空隙；7）上樣后，要蓋上電泳槽的蓋子平衡5～10 min，使薄膜完全濕潤后，再進行電泳。

2.4 電泳

將電泳儀電源與電泳槽的正負極正確連接后，打開電泳儀電源進行通電電泳。因為使用的電泳儀和電泳槽不同，以及每次實驗所上樣的薄膜數量也不一樣，所以不能直接照搬實驗教材[1]所給的電壓110 V，電流0.4～0.6 mA/cm膜寬（薄膜數量的總寬度），通電時間45～60 min進行電泳。實踐也證明，這樣電泳所得到的圖譜蛋白分離不好，效果較差。因此，應從實際出發，根據濾紙橋正負極之間的寬度和所放薄膜數量的多少來計算所用的電壓和電流。經過反復試驗，電壓一般穩定在130 V，電流控制0.6～0.8 mA/cm膜寬。由于本實驗一直安排在秋季末進行，天氣比較涼，所以電泳時間應當適當延長，控制在70～90 min，所得到的電泳圖譜分離效果比較好。

電泳過程中，電極緩沖液的離子強度和pH的改變會影響到血清蛋白的分離效果。緩沖溶液的離子強度越高，帶電質點的泳動速度越慢，反之則越快；pH距等電點越遠，質點所帶電荷越多，泳動速度越快，反之則越慢[9]。有研究[10]證實：通過混合正負極電極緩沖液的方法，能顯著延長緩沖液的使用時效。因此，每次電泳后，應及時檢測緩沖液pH，特別是陽極（正極）pH的變化，電泳2～3次后，將正負極緩沖液混合后使用，并觀察實驗后圖譜的分離效果，如分離不好，應全部倒掉，重新配制新的電極緩沖液，保證實驗結果的準確性。另外，電泳開始后，嚴禁再取放薄膜，以防觸電，發生事故。

2.5 染色

染色時應將薄膜完全浸在染色液里，并時不時晃動裝有染色液的培養皿，使其充分染色。如染色多條，要避免薄膜之間相互重疊，否則會造成染色不均，脫色后背景色淺的情況。染色時間一般應掌握在10 min左右。用過的染色液可以回收重復利用，節約資源。但有研究[11]發現，染色液重復使用次數過多，會使蛋白區帶染色不均，出現空泡樣現象。因此，一旦出現此種情況，應立即重新配制染色液。

2.6 漂洗

漂洗時應采用“少量多漂”或“連續漂洗”[4]的方法?！吧倭慷嗥贬槍€組學生，每次用少量能沒過薄膜的漂洗液漂洗，一般3～4次就能漂洗干凈?！斑B續漂洗”針對多組學生，放置幾個盛有漂洗液的培養皿，依次排開，學生連續漂洗。這兩種方法的運用，都能達到漂洗的效果，且節約資源，保護環境。

3 結束語

綜上所述，諸多因素影響著血清蛋白醋酸纖維薄膜電泳，實驗中任何一個環節的處理不當，都會影響實驗結果的準確性和完整性。為了獲得好的實驗結果，滿足實驗教學目的，達到實驗教學效果，除了教輔人員認真進行課前準備，做好預實驗外，還需要課前讓學生提前預習實驗內容，了解實驗操作要點；課上認真規范學生操作，把握每個操作環節；課后及時總結實驗經驗和教訓。相信注意了以上細節，血清蛋白醋酸纖維薄膜電泳的成功率將大大提高。

[1]陳鈞輝,李俊,等.生物化學實驗[M].4版.北京∶科學出版社,2008∶108-110.

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An Analysis of Factors that Influence Cellulose Acetate Membrane Electrophoresis Experiment of Serum Protein and Its Improvements

Yu Lejun, Liu Chenguang

The cellulose acetate membrane electrophoresis experiment of Serum protein is one of the required biochemical experiments at university. As there exist many factors influencing the experiment, this paper is to focus on the overall analysis of each possible influencing factor and the improvement measures of the experiment. This paper aims to offer useful suggestions for experimenters and help to conduct a successful cellulose acetate membrane electrophoresis experiment of serum protein.

Serum protein; acetate film; experimental apparatus

Q5-33 G642.423

B

1671-489X(2013)12-0132-03