強直性脊柱炎與HLA-B27基因亞型動態定量表達的相關性研究*

黃建民 李榮需 周玲 陳冬萍 劉永青 林周勝

強直性脊柱炎（Ankylosing Spondylitis AS）是一種類風濕因子陰性，主要累及中軸關節和肌腱韌帶附著點的慢性進行性炎癥疾病，可引起腰痛、晨僵、脊柱活動受限、駝背畸形、外周關節受累、肌腱端炎、足跟痛等關節癥狀以及眼部前葡萄膜炎、心血管表現、肺部表現、骨質疏松等關節外癥狀，AS致殘率高，早期確診對AS患者非常重要。AS與HLAB27（Human Leucocyte Antigen B27，人類白細胞抗原B27）關系密切已被公認，90%以上的AS患者HLA-B27呈陽性。人們發現HLA-B27在基因水平上存在較大異質性，存在多個等位基因，不同亞型有著不同的地域和人種分布特點。另外HLA-B27同一亞型在不同人群中與AS的關聯也可不同。本研究將對東莞地區HLA-B27陽性患者及健康人的HLAB27基因亞型進行檢測，揭示本地區主要致病亞型及可能的保護亞型，并從HLA-B27基因亞型的動態表達量揭示與AS的相關性，為本地區AS的防治提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2010年3月-2012年12月本院骨科門診HLA-B27陽性的AS確診患者100例（符合1983年修訂的紐約標準），男81例，女19例， 年齡13～70歲，平均（29±8.37）歲；HLA-B27陽性健康對照組30例，男24例，女6例，年齡14～65歲，平均（30±6.45）歲。兩組年齡、性別等一般資料比較差異無統計學意義（P>0.05），具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 試驗儀器與試劑 BDcanto2流式細胞儀由美國BD公司生產，HLA-B27熒光抗體F1（FITC）、CD3熒光抗體F2（PE）、校準微球和溶血素均來自BD公司。PCR儀器購自上海宏石SLAN，高速離心機購自ACI公司，型號PK121R。電泳儀購自Bio-Rad公司，型號PvowerPAC200，全血DNA提取試劑盒、PCR試劑盒購自寶生物大連有限公司，DNA測序儀由美國ABI公司生產，型號3130。

1.2.2 應用流式細胞術定性檢測外周血T淋巴細胞HLAB27 定性檢測：抽取HLA-B27陽性AS患者及HLA-B27陽性健康對照組外周靜脈血100 uL，EDTA抗凝，采用BD公司HLA-B27試劑盒，按照說明書步驟進行，在BDcanto2流式細胞儀上檢測，結果判斷為陰性/陽性。

1.2.3 HLA-B27基因亞型測定 采用PCR-SSP（序列引物擴增法）技術檢測HLA-B27陽性AS患者及HLA-B27陽性健康對照組HLA-B27亞型的DNA。酚氯法提取外周血液細胞DNA，按照WHO2009年公布的44個HLA-B27等位基因，選擇相關亞型的引物試劑盒，進行DNA擴增，凝膠電泳分離并用熒光染色來檢測PCR反應的最終產物。

1.2.4 HLA-B27亞型的mRNA定量 熒光實時定量RTPCR技術檢測HLA-B27陽性AS患者及HLA-B27陽性健康對照組HLA-B27亞型的mRNA，Trizol法提取外周血液細胞RNA，逆轉錄為cDNA，熒光實時定量擴增，觀察和記錄結果。

1.3 統計學處理 采用SPSS 10.0統計軟件，計量資料用（±s）表示，兩組HLA-B27mRNA 表達水平比較采用t檢驗，對HLA-B27mRNA 表達水平與強直性脊柱炎患者疾病活動指數進行Pearson相關統計分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 100例HLA-B27陽性AS患者檢出HLA-B2704亞型55例，HLA-B2705亞型45例，30例HLA-B27陽性健康對照組檢出HLA-B2704亞型13例，HLA-B2705亞型12例，HLA-B2706亞型3例，HLA-B2709亞型2例。

2.2 100例HLA-B27陽性患者HLA-B27mRNA 表達水平最低值為1.16，最高值為37.01，均值（7.77±6.19），30例HLA-B27陽性健康對照組表達水平最低1.05，最高值2.10，均值（1.51±0.27），兩組比較差異有統計學意義（P=0.002）；HLA-B27陽性患者HLA-B27mRNA 表達水平與強直性脊柱炎患者疾病活動指數密切相關（R=0.707）。

3 討論

AS是一種主要累及中軸關節的慢性進行性炎癥疾病，臨床表現為腰、骶以及下肢關節疼痛，晚期患者脊柱僵硬、活動受限。我國AS發病率約為0.3%，多見于中青年男性。AS致殘率高，早期確診對強直性脊柱炎患者非常重要。目前的AS確診方法主要是依靠臨床表現和影像學、實驗室檢查結果。AS與HLA-B27關系密切已被公認，90%以上的AS患者HLA-B27呈陽性。1973年Brewerton和Schlosstein[1-2]首次報道HLA-B27與AS相關以來，AS是迄今已知的HLA-B27與疾病關聯最強、最典型的疾病。因此臨床研究中找出本地區HLA-B27基因亞型及基因亞型表達量與AS的病情關系，為本地區AS的診治提供理論和臨床依據具有重要意義。

研究顯示，HLA-B27亞型在不同的種族和地區中分布情況不同。2009年WHO正式命名的HLA-B27等位基因已達44個，不同亞型有著不同的地域和人種分布特點[3]，如B2705亞型幾乎見于所有人種，但B2703亞型主要見于西非人群，而B2704亞型則是中國漢族人的優勢亞型。另外HLA-B27同一亞型在不同人群中與AS的關聯也可不同。有報道認為，2705、2704、2702亞型與AS的發生呈正相關，而2703、2708、2709、2707與AS的發生呈負相關[4-6]，而2706亞型則被普遍認為是AS的保護性基因。本研究顯示：本地區HLA-B27陽性患者僅發現2704與2705亞型，且2704亞型占55%，2705亞型占45%，HLA-B27陽性健康者發現4種亞型，2704亞型占43.33%，2705亞型占40%，2706亞型占10%，2709亞型占6.7%。揭示本地區主要亞型分布為2704亞型與2705亞型，且2704亞型為優勢亞型，而2706亞型及2709亞型僅見于HLA-B27陽性健康者，提示2706亞型及2709亞型為本地區保護亞型。

HLA-B27在AS發生中的病理作用目前尚不十分清楚。作為一種重要的免疫分子，HLA-B27主要功能是與抗原結合并將其提呈給T淋巴細胞，這一功能在AS和正常人中都有表現。HLA-B27重鏈可以形成同源二聚體，大多數AS患者T淋巴細胞都能表達這種二聚體的配體，這說明HLAB27重鏈二聚體可能參與了AS的病理發生過程，而HLAB27可能在免疫過程中具有重要作用[7-8]。因為通過檢測HLA-B27基因亞型無法有效區分AS患者及HLA-B27陽性健康人，采用定量PCR檢測HLA-B27mRNA表達有可能解決這一問題。本研究對HLA-B27陽性AS患者及HLAB27陽性健康對照組均進行了RT-PCR技術檢測，發現兩組HLA-B27mRNA表達量差異有統計學意義（P=0.002），HLA-B27陽性AS患者呈現高表達，而HLA-B27陽性健康對照組呈現低表達。這也說明了本地區雖然HLA-B27基因亞型無論是AS患者或是健康人均是2704及2705，基因亞型高表達者患病，低表達者未患病。同時提示基因型低表達的HLA-B27陽性健康者隨著基因亞型表達量增加可能成為AS患者，因此臨床工作中對HLA-B27陽性健康人進行RTPCR技術檢測HLA-B27mRNA表達量，作為一種輔助診斷的有效手段，可以更早期發現AS患者，使AS的防治真正達到早發現、早診斷、早治療，將AS的致殘率降到最低。

AS患者關于其疾病活動性評價，目前臨床大多數專家認可的、應用最為廣泛的是畢氏強直性性脊椎炎疾病活動指數（BASDAI），它與腰椎MRI急性炎癥評分有很好的一致性[9]，雖然新的直性脊柱炎病情活動度評分（ASDAS）在判斷AS患者病情活動度時的敏感性稍高[10]，但畢氏法僅需患者對自身病情的主觀評價，無需MRI及過多的抽血化驗等高成本檢查，在中國仍最常用，能夠反映患者的病變活動性。本研究發現HLA-B27陽性患者HLA-B27mRNA 表達水平與AS患者畢氏疾病活動指數密切相關（R=0.707），這也為進一步從分子水平治療AS提供了有力證據，未來可能通過轉錄水平的調控，降低AS患者的HLA-B27mRNA表達量來減輕AS患者的病情。但HLA-B27是人類基因中的一個等位基因，具有高度的多態性，不同地區及種族中存在明顯差異，仍需進一步從轉錄、翻譯調控等分子水平作更多的研究[11]?？傊?，本研究揭示本地區HLA-B27基因主要致病亞型和可能的保護亞型，并從分子轉錄水平揭示了HLA-B27基因動態表達量與強直性脊柱炎患者疾病活動指數相關性，為臨床及早防治AS提供了新的理論依據，具有重要臨床意義。

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