食鹽對咸蛋黃蛋白質特性的影響

鄭 華，彭 輝，林 捷,*，呂雪娟

(1.華南農業大學食品學院，廣東 廣州 510642；2.廣東湯臣倍健生物科技股份有限公司，廣東 珠海 519040；3.華南農業大學分析測試中心，廣東 廣州 510642)

蛋黃是一個含蛋白質、脂肪及水的雜合體系，由于蛋白質的存在，蛋黃具有良好的黏性、起泡性及乳化性等功能特性，被廣泛用于食品工業[1]。蛋白質的變性會導致蛋黃諸多加工特性如乳化性和流變性的改變。禽蛋在腌制過程中，由于高濃度食鹽的作用，導致咸蛋黃出現了收縮凝固硬化，經高溫熟化后還出現出油起沙等現象[2]，腌制使禽蛋的理化指標[3]、蛋黃的品質、脂肪等成分發生了變化[4-5]，是否導致蛋黃中蛋白質分子結構發生改變，國內外的研究均鮮見報道。目前用于蛋白質結構分析方法主要有X射線衍射、圓二色譜(circular dichroism，CD)、核磁共振(NMR)等技術，但這些技術在蛋白質分析時均存在局限性，X射線衍射技術需要獲得合格的晶體，核磁共振技術只能測定小分子蛋白質結構，圓二色譜技術只能應用在很窄濃度范圍內的澄清溶液中[6]。蛋黃體系中蛋白質含量＞15%，且多為大分子結構，很難獲得蛋白質單晶體。傅里葉變換紅外光譜(FT-IR)技術是一種研究蛋白質變性過程中二級結構變化的有效、簡捷的方法[7]，能夠根據蛋白質等生物大分子對應的紅外光譜特征吸收峰譜型、強度、頻率等譜學參數的變化，來分析其結構的變化。本研究通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)、差示掃描量熱(DSC)、FT-IR等技術對腌制蛋黃進行分析測試，研究禽蛋在腌制過程中蛋白質結構發生的變化。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮鴨蛋(產蛋后5d以內) 廣東開平市旭日蛋品有限公司。

考馬斯亮藍R-250 國藥集團化學試劑有限公司；5,5’-二硫代二硝基苯甲酸鹽(DTNB，分析純) 美國Sigma公司；低分子質量標準蛋白 日本TaKaRa公司。

1.2 儀器與設備

DSC Q10差示掃描量熱儀 美國TA公司；UV1240紫外分光光度計 日本島津公司；Vertex70傅里葉變換紅外光譜儀 德國Bruker公司；TGL-16A高速離心機 江蘇常州朗越公司；XHF-I高速均質機 上海金達公司；DYY-12C三恒多用電泳儀 北京六一公司。

1.3 方法

1.3.1 稻草灰腌制法

稻草灰5.0kg、食鹽1.75kg、水3.0kg，用于腌制300枚新鮮蛋。將食鹽、稻草灰混勻，加水充分攪拌直到具有較強的黏性，形成灰漿。將挑選好的鴨蛋在灰漿內滾一層，放置在密閉容器中腌制。

1.3.2 蛋黃中食鹽含量測定

采用硝酸銀滴定法。

1.3.3 蛋黃可溶性蛋白質含量測定

采用考馬斯亮藍測定法。

標準曲線制作：將牛血清蛋白(BSA)配制為0～100μg/mL的5個梯度標準溶液，加入0.1mg/mL考馬斯亮藍G-250染色液，在595nm波長處測定吸光度，繪制標準曲線。

樣品處理：取蛋黃樣品1g加0.05mol/L Tris-HCl緩沖溶液(pH6.5)50mL，用高速均質機5000r/min均質2min，然后用高速離心機10000r/min高速離心20min，取上清液，于595nm波長處測定吸光度。樣品中蛋白質含量計算如式(1)。

式中：ρ為標準蛋白含量/(μg/mL)；VT為提取液總體積/mL；m為樣品質量/g。

可溶性蛋白干基含量計算：濕基含量是指蛋黃中可溶性蛋白的質量占蛋黃總質量的質量分數；干基含量是指蛋黃中可溶性蛋白的質量占蛋黃總固體干物質質量的質量分數。

1.3.4 蛋黃蛋白質的巰基測定[8]

稱取1.0g蛋黃樣品加入0.1mol/L磷酸緩沖液(pH8.0)定容至25mL。取1mL樣品液與3mL磷酸緩沖液(pH8.0)混合均勻，加入40μL Ellman試劑(40mg DTNB溶于10mL 0.1mol/L、pH8.0的磷酸鹽緩沖液)，顯色30min，測定412nm波長處的吸光度。以不加樣品而加Ellman試劑為空白對照，以不加Ellman試劑而加樣品溶液測其渾濁度。巰基計算如式(2)。

式中：A412nm為加DTNB時樣品的吸光度減去不加DTNB時樣品的吸光度；ρ為蛋白質質量濃度/(mg/mL)；D為樣品稀釋倍數。

1.3.5 蛋黃蛋白質的SDS-PAGE分析

SDS-PAGE參考Laemmli[9]的方法：5%分離膠和12%濃縮膠。

樣品處理：取3g蛋黃加蒸餾水27mL，5000r/min均質1min，然后12000r/min常溫離心10min，上清液采用考馬斯亮藍法測定蛋白質含量。用樣品溶解液調整到蛋白質質量濃度1mg/mL，置沸水浴3min使蛋白質變性，取15μL蛋白質樣品進行電泳。

電泳條件：先采用120V電壓電泳至分離膠，后提高電壓至200V至電泳結束。采用考馬斯亮藍R-250染色液(m(考馬斯亮藍R-250)∶V(甲醇)∶V(冰乙酸)=0.1∶25∶10)進行染色過夜。用含40%甲醇及10%冰乙酸的洗脫液脫色。

1.3.6 蛋白質的DSC測定

通過前期對新鮮蛋黃理化指標的分析，水分含量為47%。將咸蛋黃樣品水分調整到新鮮蛋黃的水平，以萬分之一電子天平精確稱取蛋黃樣品15mg置于鋁盤，用空白鋁盒作對照，樣品從20℃掃描到90℃，升溫速率5℃/min，根據峰面積和峰值溫度分析蛋黃蛋白質的轉變溫度及熱焓變ΔH。

1.3.7 FT-IR測定蛋白質二級結構

用干燥的空氣連續吹掃樣品倉，消除水蒸氣的影響，精確稱取蛋黃樣品100mg蛋黃液平鋪于水平衰減全反射附件(ATR)上進行全波段(4000～600cm-1)掃描，掃描次數為64次，分辨率為4cm-1。以相應的空氣和水作為背景，扣除背景后得到紅外光譜圖。圖譜采用Vertex70數據處理軟件，所得的紅外譜圖與相同條件下水的光譜圖進行差減，并以2000～1700cm-1處基本差減為一條直線為依據，從而得到相應蛋白質的紅外譜圖。差減后的譜圖在1600～1700cm-1范圍內進行滿刻度偏轉(full-scale deflection，FSD)處理，然后進行基線校正，得到分辨率較高的原譜。手動調整各子峰的峰高和半峰寬，對圖譜進行曲線擬合，計算機多次擬合使殘差小于0.01。擬合之后重疊在一起的不同譜帶完全分開，根據其積分面積計算各二級結構的相對百分含量。

1.4 統計分析

運用SPSS13.0統計軟件，進行多重比較分析，數據通過LSD統計檢驗。

2 結果與分析

2.1 蛋黃中食鹽含量的變化

圖1 腌制過程中蛋黃食鹽含量變化Fig.1 Change in salt content of egg yolk during salting

由圖1可知，在整個腌制過程中，蛋黃中食鹽含量呈現緩慢升高的趨勢。將食鹽含量對腌制時間進行線性回歸，得到食鹽含量隨時間的模擬方程，而回歸曲線的一階導數即為食鹽的滲透速率。蛋黃的模擬方程為一次函數，擬合方程為Y= 0.2385X+0.5803(R2=0.99)，所以蛋黃中的食鹽滲透速率基本不變。

2.2 蛋黃中可溶性蛋白含量分析

圖2 不同腌制階段可溶蛋白質含量變化Fig.2 Soluble protein content of egg yolk at different time

可溶性蛋白指能夠以小分子狀態溶于水或其他溶劑的蛋白。由圖2可知，咸蛋腌制過程中，可溶蛋白質的含量呈現緩慢上升趨勢，這個結果與蛋黃中食鹽含量的變化呈現正相關，這是由于蛋白質在一定食鹽濃度范圍內具有鹽溶作用，從而導致腌制過程中可溶性蛋白質含量增加。圖2中出現一個有趣的現象，即在腌制的第3周，蛋黃中可溶性蛋白質的干基含量比未腌制(新鮮)時還低，這可能是因為在腌制過程中，隨著蛋黃的脫水(新鮮蛋黃水分含量47.2%，腌制至第3周時為24.5%)，使蛋黃中部分可溶性蛋白質流失到蛋清中，低濃度食鹽的鹽溶作用所產生的可溶性蛋白質甚至少于所流失的部分，從而致使蛋黃中總的可溶性蛋白質含量有所減少。隨著蛋黃水分的流失，蛋黃逐漸凝固硬化，使蛋黃失去流動性。蛋黃中蛋白質在食鹽的鹽溶作用下進一步被溶出，導致腌制后期可溶性蛋白質含量增加。蛋黃可溶性蛋白含量的增加，與蛋黃中食鹽的離子強度及蛋黃的顆粒結構有關。蛋黃顆粒主要以高密度脂蛋白-卵黃高磷蛋白通過鈣-磷橋形成復合物的形式存在，腌制過程中隨著食鹽濃度增加，導致維持顆粒結構的鈣-磷橋中的Ca2+被Na+取代，從而破壞了蛋黃的顆粒結構，使可溶性的卵黃高磷蛋白被溶出[10]。

2.3 蛋黃蛋白質的巰基含量

二硫鍵是維持蛋白質高級結構主要的次級鍵之一，在許多物理、化學及其他作用的條件下，二硫鍵會被破壞，形成巰基，從而破壞蛋白質的空間結構。在腌制過程中，食鹽是否會對蛋黃蛋白質的二硫鍵產生作用，從而發生巰基的變化，如圖3所示，在實驗所檢測的幾個不同的階段，蛋黃蛋白質中的巰基含量發生了變化。在第3周時，巰基含量明顯高于其他階段，隨著腌制時間的延長，巰基含量又會呈現明顯的降低。在腌制過程中，隨著蛋黃中食鹽含量的增加，維持蛋白質空間結構的二硫鍵在食鹽作用下被破壞而斷裂，生成巰基，且在第3周時達到最大值，而隨后巰基含量逐漸減少。巰基減少的原因可能是以下因素所導致：首先由于蛋黃脫水，使蛋黃逐漸失去流動性，蛋白質濃度升高，且蛋黃中食鹽含量也逐漸增加(圖1)，蛋白質在食鹽的進一步作用下，使巰基在新作用力的作用下又結合形成新的二硫鍵。腌制過程中蛋白質二硫鍵與巰基之間的變化規律與蛋黃的水分含量、食鹽含量等因素之間的關系還有待進一步的研究。

圖3 不同時間腌制蛋黃蛋白質的巰基含量變化Fig.3 Change in sulfhydryl content of egg yolk at different time

2.4 蛋黃蛋白質SDS-PAGE分析

以標準蛋白SDS-PAGE的相對遷移率作對照，根據樣品的相對遷移率，計算得到各組分的分子質量。由圖4可知，標準蛋白的分子質量區間為14.0～97.2kD。在電泳圖譜中發現含量較高的蛋白質條帶分子質量為32、46、56kD。對照各樣品的電泳結果發現，所有電泳條帶均清晰可見，且各電泳條帶幾乎不存在差異，即使是新鮮蛋樣品與腌制到第15周的樣品也不例外。結果表明，腌制過程中盡管食鹽對蛋黃蛋白質的空間結構造成了一定程度的改變，但并未對蛋白質的肽鏈結構發生作用，即使是腌制到第15周，蛋白質的肽鏈結構與未經腌制時幾乎是相同的，腌制中食鹽并未導致蛋白質的肽鏈發生斷裂或聚合而生成新的蛋白質組分。

圖4 不同腌制時間蛋黃蛋白質的SDS-凝膠電泳圖Fig.4 SDS-PAGE pattern of fresh duck eggs with different portions and duck eggs salted for different lengths of time

2.5 蛋黃蛋白質DSC分析

蛋白質是一類與生命直接相關的生物大分子，在正常情況下以緊密折疊結構存在。天然蛋白質分子受到某些物理或化學因素作用時，常出現生物活性喪失，或某些物理、化學常數發生改變，這種現象稱為蛋白質的變性，蛋白質的變性常伴隨著熱力學參數的變化[11]。而蛋白質的熱變性溫度和焓變是反映蛋白質變性的主要熱力學參數。如表1可知，新鮮蛋黃樣品有一個明顯的最大變性溫度為79.06℃的吸熱峰值出現，這個峰代表著低密度脂蛋白(LDL)和高密度脂蛋白(HDL)的總蛋白變性峰，腌制后的蛋黃峰值區間在79.04～82.09℃之間。蛋黃漿液里的LDL對熱較敏感，而相比之下HDL和卵黃磷蛋白有更強的耐熱性。蛋黃腌制以后的變性溫度會升高(P＜0.05)，總焓變代表樣品中未變性蛋白質的比例。新鮮蛋黃蛋白質的焓變值為0.833J/g，而腌制以后的總焓變明顯下降(P＜0.05)，說明蛋白變性的程度加深。蛋白質在高水分環境中更容易變性，主要是由于加熱使水分子運動加劇，導致蛋白質的次級鍵斷裂。但也有研究[12]表明，具有高比例的疏水基團或高緊密結構的蛋白質具有較高的焓變溫度。

表1 腌制不同時間蛋黃蛋白質的焓變值和變性溫度(±s, n＝3)Table 1 Tmax and enthalpy of proteins from duck eggs salted at different time(±s, n＝3)

表1 腌制不同時間蛋黃蛋白質的焓變值和變性溫度(±s, n＝3)Table 1 Tmax and enthalpy of proteins from duck eggs salted at different time(±s, n＝3)

腌制時間/周 蛋黃樣品部位 T max/℃ ΔH/(J/g)0內層 79.06±0.02 0.833±0.043外層 79.06±0.02 0.833±0.043 3內層 82.09±0.23 0.419±0.112外層 80.09±0.61 0.428±0.124 15 內層 79.04±0.08 0.199±0.111外層 80.57±0.08 0.287±0.096

2.5 蛋黃蛋白質的FT-IR光譜分析

酰胺Ⅰ帶(1600～1700cm-1)的紅外吸收主要與C=O的伸縮振動有關，Jackson等[13]將1600～1639cm-1指認為β折疊、1640～1650cm-1為γ-隨機結構(C=O與水形成氫鍵)、1650～1658cm-1為α螺旋結構、1661～1700cm-1為T轉角結構。本研究結合Miranda[14]的研究結果，進一步將1600～1625cm-1指認為β1，即蛋白質分子間的強相互作用氫鍵；1690～1700cm-1為β2，即蛋白質分子間形成的非平面弱氫鍵(偶極子轉換引起的)作用；β1+β2為蛋白質分子間的總相互作用氫鍵；1626～1639cm-1為分子內β折疊氫鍵，α螺旋+β折疊為蛋白質分子內總相互作用氫鍵，代表蛋白質分子的緊密程度。

表2 腌制過程中蛋黃蛋白質二級結構變化Table 2 Variation of secondary structure constitution during salting

如表2所示，新鮮蛋黃蛋白質二級結構組成為：β折疊32.7%，其中β113.34%、β2含量較低僅為1.16%、α螺旋41.97%、T轉角17.46%，不含γ無規則卷曲結構。蛋黃中的蛋白質二級結構以α構象為主，α螺旋+β折疊構象含量約占總構象的75%，即蛋白質分子內總相互作用的氫鍵較強。新鮮蛋黃與腌制后的蛋白質均未有γ卷曲結構出現。蛋黃在腌制過程中，二級結構中氫鍵變化較為明顯，腌制成熟過程蛋白質的α螺旋+β折疊結構含量下降明顯，成熟以后(第5周)幾乎無變化。而咸蛋黃呈現起沙現象的初期(第3周)出現外部含量明顯低于內部蛋黃，這是由于外部脫水作用比內部強烈，導致外部氫鍵減弱明顯，而內部變化緩和，和新鮮蛋較為接近。

圖5 蛋黃內外層不同腌制階段的二級結構變化Fig.5 Change in secondary structure of egg yolk during salting

由圖5可知，蛋黃內、外兩層各結構變化規律相似，主要是由腌制過程中滲透脫水引起的，成熟后(第5周)各二級結構變化逐漸緩慢。α螺旋在各結構中變化最明顯，在第5周急劇下降到最低后又緩緩上升；T轉角在腌制的4個階段持續上升，但速度較緩慢。

而對于β1、β折疊是先減小后增大再減小的趨勢。在腌制到成熟時(第5周)，蛋白質二級結構的變化最明顯，所有結構都發生很大的變化，β折疊、β1、β2和T轉角結構增加，α螺旋結構減少，說明食鹽導致蛋白質分子間的作用力發生了明顯變化。α結構含量減少的同時T轉角結構增加較明顯，即在這個過程中α螺旋大部分轉化為T轉角結構。蛋白質的二級結構指的是蛋白質分子局部區域內，多肽鏈沿一定方向盤繞和折疊的方式，主要是由分子內的氫鍵維系的局部空間排列，包括α螺旋、β折疊、轉角、無規卷曲等。蛋白質的變性是指蛋白質在某些物理和化學因素作用下，其特定的空間構象會改變而導致蛋白質理化性質的改變和生物活性的喪失，其實質是蛋白質二級結構發生變化[15]。

3 結 論

腌制15周過程中蛋黃可溶性蛋白質含量增加，表明腌制過程蛋白質存在鹽溶現象；巰基含量在食鹽作用下也發生變化，表明蛋白質亞基受到食鹽作用的影響；DSC掃描表明鹽分對蛋黃蛋白質的耐熱性有促進作用；食鹽沒有對蛋白質肽鏈結構產生影響，蛋黃中含量較大的為分子質量32、46、56kD的3種蛋白質條帶，而各階段的條帶無明顯差異。食鹽導致蛋白質的二級結構發生較大變化，新鮮蛋黃蛋白質的二級結構以α螺旋和β折疊結構為主，腌制以后α-、β-結構部分轉化為T轉角。通過FTIR光譜對腌制過程中咸蛋黃中蛋白質二級結構的分析發現，腌制過程導致了咸蛋黃蛋白質發生了二級結構的改變，即是蛋白質發生了變性。

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