半連續發酵及其應用研究進展

孫文敬，劉長峰，周延政，王大明，崔鳳杰，余 琳

(1.江蘇大學食品與生物工程學院，江蘇 鎮江 212013；2.江西省生物發酵食品添加劑工程技術研究中心，江西 德興 334221；3.百勤異VC鈉有限公司，江西 德興 334221；4.河北師范大學生命科學學院，河北 石家莊 050016)

半連續發酵及其應用研究進展

孫文敬1,2，劉長峰1,2，周延政2,3，王大明4，崔鳳杰1,2，余 琳1,2

(1.江蘇大學食品與生物工程學院，江蘇 鎮江 212013；2.江西省生物發酵食品添加劑工程技術研究中心，江西 德興 334221；3.百勤異VC鈉有限公司，江西 德興 334221；4.河北師范大學生命科學學院，河北 石家莊 050016)

半連續發酵是一種重要的生化培養方式。本文介紹半連續發酵的應用領域，詳細綜述半連續發酵的分類、特點、與連續發酵的聯系以及半連續發酵過程中的菌體循環利用方法，并結合當前代謝工程和過程控制策略的發展趨勢，對半連續發酵技術的應用前景進行展望。

半連續發酵；研究現狀；應用領域；展望

半連續發酵(semi-continuous fermentation)，又稱半連續培養、反復分批培養或換液培養，是指在分批培養的基礎上，周期性地放出部分含有產物的發酵液，然后再補加相同體積的新鮮培養基的發酵方法。在實施半連續發酵的操作過程中，補充了新營養成分的反應體系的培養條件與分批培養條件相同，且反應器內培養液的總體積基本保持不變[1]。半連續培養技術已在工業生產領域逐步得到應用，但與其相關的整合性論述卻很少。本文主要綜述半連續發酵過程以及操作工藝的國內外研究現狀，以期為該工藝更廣泛的應用提供參考。

1 半連續發酵的應用范圍

半連續發酵技術在工業生產和科學研究中已經得到了比較廣泛的應用，主要涉及菌體的生產、微生物代謝產物的生產、垃圾的厭氧消化和動物消化道內微生物的體外培養。

1.1 菌體的生產

對于部分微藻的培養，無論是在規模化生產中還是在實驗室研究中，半連續培養模式都是常用的模式之一[2-5]。在微藻的半連續培養過程中，培養液的更新率對菌體生長和細胞內生化組分都有重要影響，是一個比較關鍵的參數[6]。

1.2 微生物代謝產物的生產

應用半連續培養工藝規模化生產微生物代謝產物的實例主要有：醋酸、青霉素和酒精。

1.2.1 醋酸

采用深層液體發酵工藝生產醋酸，醋酸的生成速率主要取決于醋酸菌的生長速率和活菌體濃度[7]。在連續培養體系中，由于醋酸菌的比生長速率較低以及環境中高濃度醋酸的存在，導致了比產物生成速率較低，因此高產酸率和高濃度的醋酸發酵不宜采用連續發酵工藝[7]。在醋酸的規模化生產中，目前廣泛采用的是半連續發酵工藝[8]。以德國Heinrich Frings公司為例，其醋酸生產的基本工藝流程如下：當發酵進行至乙醇質量濃度接近于0時，放出40%的發酵液，然后加入等體積的新鮮酒醪進行再發酵，并保持整個發酵過程中通氣和溫度的恒定，醋酸的質量濃度可以達到13.3g/100mL。如果新鮮酒醪的添加方式正確和放罐時機掌握恰當，能夠有效縮短下個周期發酵的延滯期，直接進入對數生長期[7]。

有關多級半連續發酵、發酵過程的控制和耐高濃度醋酸菌種的應用等相關研究[9-11]也有報道，其主要目的在于進一步提高發酵液中的產物濃度。

1.2.2 青霉素

青霉素被發現后的數10年間，該產品的生產技術得到了迅猛發展[12]。最初的青霉素半連續發酵生產純粹是依據經驗進行控制的[13]，但對于這樣一個時變性和非線性的復雜發酵過程，僅僅依靠經驗進行控制不能滿足現代化生產的要求[14]，為此許多學者致力于實現青霉素半連續發酵過程的模型化及在此基礎上實行的優化控制研究[15-17]。

發酵動力學研究表明，比生長速率為0.015h-1時青霉素生產菌的生產能力最強。該研究結果應用于工業生產中，就形成了目前青霉素發酵工業中普遍采用的半連續流加發酵工藝，我國工業界通俗地稱其為青霉素發酵帶放工藝[18]。

青霉素半連續發酵工藝的大致操作為：達到發酵終點時，放出20%～40%的發酵液進入后續的提取工藝，同時補充相同體積的新鮮培養基繼續進行發酵，這種操作可以反復進行多次而不會導致產量減少，還能增加發酵罐的體積利用率[19]。徐猛[20]報道了另一種半連續發酵生產青霉素的方法，即將青霉素半連續發酵過程中帶放的發酵液，通過管道轉移到另一個無菌發酵罐中進行補料再培養，直至青霉菌進入自溶階段。該方法充分利用了處于穩定期青霉菌的次級代謝能力，明顯縮短了生產周期，有效降低了生產成本。

1.2.3 酒精

酒精的規模化生產目前主要采用連續濃醪發酵工藝，尤其是年產幾十萬噸的大型生產企業。一般在4～6級連續發酵工藝中，通過減少整體返混的方式來緩解產物抑制[21]。有關采用半連續發酵工藝生產酒精的研究也有報道，如劉曉峰等[22]在特大型發酵罐生產酒精的過程中，從設備投資和雜菌污染控制等方面對連續發酵工藝與半連續發酵工藝進行了比較，得出了在特大型發酵罐中采用半連續發酵工藝生產酒精更為合理的結論。表華偉[23]認為，半連續發酵生產酒精，一方面相對于分批發酵而言提高了設備利用率，縮短了發酵周期；另一方面為將來的連續發酵生產酒精打下了基礎，以便整個酒精生產流程實現自動化控制。岳國君等[24]對酒精的生產技術做過評述，認為國外企業在生產酒精的過程中，通過將多級連續發酵工藝、同步糖化發酵工藝以及酵母的自絮凝技術相結合，顯著降低了成本，優于國內企業多采用的半連續發酵工藝。

除醋酸、青霉素和酒精之外，尚有許多微生物代謝產物已在實驗室規模上實現了半連續發酵生產，其生產效率遠高于現有的分批發酵或補料分批發酵模式，如乳酸[25]、富馬酸[26]、甘油[27]、脂肪酶[28]、二羥丙酮[29-30]等。對于這些代謝產物，實際生產過程中是否采用半連續發酵工藝應結合具體情況綜合考慮。John等[31]對以工農業廢物為原材料的乳酸發酵生產進行過評述：除了生產強度外，在其他技術指標上分批發酵工藝均優于連續發酵工藝；相對于分批發酵工藝而言，采用半連續發酵工藝可進一步提高發酵產率。因此，在原材料成本相對較高的情況下，應采用半連續發酵工藝使產率最大化；在設備及能耗成本相對較高的情況下，應采用連續發酵工藝使生產強度最大化。

1.3 垃圾的厭氧消化

垃圾的厭氧消化是指在厭氧微生物的作用下，垃圾中的有機物發生降解并趨于穩定的過程，該過程由水解產酸階段和厭氧發酵產氣階段組成[32]。目前，垃圾的厭氧生物處理方式較多，其中也包括半連續操作模式，如Wang等[33]分別在實驗室規模和實際生產規模中，對分批操作模式和半連續操作模式下甲烷的生產強度和揮發性固體的轉移量進行了比較。由于半連續操作模式下污泥的穩定性更高，因此其生產效率相對高于分批操作模式。Kearney等[34]研究了半連續厭氧消化過程中大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、小腸結腸炎耶爾森氏菌等幾種菌的活性，為高效進行厭氧消化提供了一定的參考。李來慶等[35]建立了番茄廢物半連續厭氧消化的動力學模型，能夠用于蔬菜廢物半連續厭氧消化過程的參數優化，并可以為該項技術的工程應用提供一定的理論指導。

1.4 動物消化道內微生物的體外培養

早在20世紀50年代，國外就開展了利用體外系統模擬胃腸生態系統的相關研究。1963年，Rufener等[36]提出連續培養系統可以用于模擬瘤胃微生物系統；20世紀80年代以來，有報道[37-38]認為采用半連續培養系統模擬腸道微生物系統能夠取得更好的效果。在研究腸道菌群對異型生物質毒性的解除作用過程中，Campbell等[37]認為連續培養與半連續培養的區別主要在于營養物添加和廢物移除的方式不同，連續培養系統雖然能夠提供相對恒定水平的營養物，使微生物保持在穩定的狀態，但回腸內的流質卻是以類似脈沖的方式進入大腸，半連續培養模式與之更為相似，因此更適合于腸道微生物生態系統的模擬。

2 半連續發酵的特點

微生物發酵可分為分批、補料分批、半連續、連續等多種模式。分批發酵的人力、物力消耗較大，每批發酵都需要進行裝料、滅菌、接種、放料、清洗等操作，工序繁瑣，發酵周期較長，生產效率較低；補料分批發酵雖可通過補料補充養分或前體的不足，但是由于有害代謝產物的不斷積累，產物合成最終難免受到阻遏；連續發酵較分批發酵和補料分批發酵生產強度大大提高，但容易遭受雜菌的污染，菌種易退化，設備投資較大，且發酵產物濃度較低；半連續發酵過程中，通過放掉部分發酵液再補入新鮮培養基，不僅可以補充養分和前體，而且代謝有害物被稀釋，從而有利于產物的繼續合成[39]。半連續發酵工藝的應用可以起到緩解產物抑制和避免代謝副產物積累的作用，改善了微生物的培養環境，有助于保持菌體活力的穩定，這也使其在某些初級代謝產物的生產過程中得到了應用，如醋酸[8]、乙醇[22]和乳酸[25]等。

對于某些次級代謝產物如青霉素[40]、赤霉素[41]、環孢菌素[42]和洛伐他汀[43]等，其最高的生產速率僅在某些瞬態條件下才能達到。采用半連續發酵工藝不僅可以使這種瞬態條件反復出現，而且還可以提高設備的利用率，因此半連續發酵工藝在次級代謝產物的生產方面有著重要的應用[44]。

除適合于動物消化道內微生物的體外培養[37]外，半連續培養模式還能滿足一些特殊微生物的培養要求。Manu等[45]在研究厭氧條件下污泥對靛類染料和偶氮染料廢水的脫色作用時指出，水流停留時間對脫色效率有關鍵影響。相對于其他的操作方式，采用半連續操作方式可以同時達到更長的水流停留時間和更高濃度的生物量，因此該操作模式比較適合于污泥對染料廢水的脫色。Tripathi等[46]在研究微藻對重金屬的生物監控作用時指出，連續培養系統和半連續培養系統均接近于天然湖泊的環境，但連續培養系統需要有精密的設備且操作繁瑣，因此半連續培養系統更適用于微藻對重金屬敏感度的研究。

3 半連續發酵的類型

3.1 單級半連續發酵

單級半連續發酵具有操作簡單和應用普遍的特點，但是它無法充分利用底物和菌體。Macias等[47]在醋酸的單級半連續發酵過程中，采用計算機模擬的方法，對不同的補料放料策略進行比較。研究結果表明對于高濃度醋酸的生產，在產物濃度達到指定值時補料放料更合適；其他情況下，在指定的時間下補料放料更合適。3.2 多級半連續發酵

鑒于單級半連續發酵往往無法充分利用底物和菌體，許多學者[48-50]嘗試構建多級反應系統來提高底物的利用率和避免代謝產物或代謝副產物在后期影響菌體的活性。為了避免發酵后期菌體大量死亡并盡可能縮短發酵周期，董晉軍等[48]采用了兩級半連續發酵工藝進行琥珀酸的生產，生產強度達到2.38g/(Lgh)，遠遠高于分批發酵和補料分批發酵的生產強度1.13、1.36g/(Lgh)，取得了較好的效果。在兩級半連續發酵生產二羥基丙酮的過程中，Bauer等[50]采用熒光原位雜交技術，研究了高濃度產物對菌體生長的抑制作用，并據此確定了兩級半連續發酵工藝中一級罐的補料放料時機(二羥基丙酮質量濃度達到82g/L)，建立了一種比較穩定高效的二羥基丙酮生產方法。

4 半連續發酵與連續發酵的聯系

相對于分批發酵而言，半連續發酵與連續發酵都要通過放出一部分發酵液并補入一部分新鮮培養基的方式，使產物生成期均得到了延長；但補料和放料方式的不同，又導致了半連續發酵工藝與連續發酵工藝之間也存在一系列的差異。

Pirt[44]認為如果以流加的方式進行反復補料分批發酵，使整個培養系統達到擬穩態(比生長速率≈稀釋率)，那么培養液的體積、稀釋率以及相關的參數都會出現周期性的變化。當反復補料分批發酵的周期趨近于無窮大、放料體積趨近于無窮小時，可以獲得近似恒化培養的穩態，獲得的產物濃度趨近但不超過恒化培養得到的濃度。由于恒化培養對化學環境要求嚴格，因此反復補料分批發酵在技術上更容易實現。

Fencl等[51]在培養產蛋白圓酵母菌體時，對半連續培養和連續培養這兩種操作方式進行了比較。認為菌體的比生長速率越低，二者的區別會越小，如果半連續培養的補料的間隔時間非常短(例如幾分鐘)，而菌體的世代時間比較長(例如1h以上)，可以認為這兩種操作方式幾乎等同。假如兩種工藝條件下酵母細胞的世代時間相同，則連續培養的稀釋率將比半連續培養高10%～15%，因此也就更具有優勢。除此之外，半連續培養過程中限制性底物濃度的波動對酵母菌體細胞的生理狀態會產生不利影響。

5 半連續發酵過程中菌體的重復利用

在半連續發酵過程中，為了提高生產效率，可以反復利用有活力的菌體。反復利用菌體主要通過離心、膜分離和固定化細胞3種方式實現。

5.1 離心

離心是將菌體從發酵液中分離出來的一種常用方法。劉永強等[52]采用離心的方法，進行了酵母反復分批發酵生產甘油的研究。在12個批次的實驗中，甘油的產量比較穩定。但Gledhill等[53]采用離心的方法進行溶脂念珠菌半連續發酵生產檸檬酸的實驗時，發現生產強度隨著發酵周期增多而逐漸降低，可能是由于菌體在離心過程和再懸浮過程中受到了傷害，從而導致其活性降低。

5.2 膜分離技術

利用膜技術回收菌體的研究由來已久。從理論上來說，根據菌體細胞大小、保持活性條件以及物料理化特性，可選擇適合于回收微生物細胞的膜，在優化膜過程操作參數的基礎上實現特定的目標[54]。一般認為，膜生物反應器的應用能夠使發酵過程實現高菌體濃度和高生產效率[55]。因此，在一些微生物代謝產物如醋酸[56]、乳酸[57]和甘露醇[58]的半連續發酵研究中，利用了膜生物反應器。

大多數有機酸發酵的細胞循環利用都是通過超濾膜組件來實現的，由于膜的孔徑較小和分離過程中的壓力較高，很容易造成膜的污染并使菌體細胞受到傷害。因此，在允許的條件下，應盡量采用微濾膜組件以提高分離效果并降低分離過程對菌體的傷害[59]。利用膜生物反應器半連續發酵生產甘露醇的過程中，整個運行設備的死體積(或稱空隙體積)和操作技術上的偏差可能導致生產強度降低，因此合理的過程設計和恰當的過濾時間至關重要[58]。近年來，利用新材料改善膜組件過濾效果已成為膜生物反應器領域的研究熱點[60-61]。

對于膜生物反應器來說，良好的密閉性是避免發酵污染的基礎[59]。除此之外，選擇合適的膜組件也是至關重要的。在利用膜反應系統連續發酵生產琥珀酸的過程中，采用中空纖維膜組件無法避免雜菌的污染[62]。為了防止染菌，有必要采用能夠耐受高溫滅菌的膜組件(如陶瓷膜組件)以保證嚴格的無菌條件。

5.3 固定化細胞技術

菌體的重復利用還可以通過細胞的固定化來實現。利用固定化細胞進行紅色素的半連續發酵生產，不僅可以使細胞生長維持在最低限度，同時可以使細胞內的酶活力得到最大限度的保護，從而達到了較高的生產強度[63]。但是，固定化細胞技術在生產中的應用仍存在一定的問題。在流化床反應器內利用多孔玻璃固定的吉利蒙假絲酵母進行木糖醇的半連續發酵生產時，其發酵過程中菌體濃度的不斷增大和各種物質轉移的障礙使比產物生成速率明顯下降[64]；在固定化酪丁酸梭菌連續發酵生產丁酸的過程中，后期產物濃度大幅下降可能是由固定化細胞的堵塞所引起的[65]。要解決這些問題，需要從細胞固定化的載體材料、細胞的生理性狀、生產工藝等多個方面進行考慮[66-67]。

6 結 語

半連續發酵是一種重要的生化培養方式，在工業生產和科學研究中正逐步得到廣泛應用。半連續發酵過程中，合理控制微生物代謝反應途徑是最大程度合成目的產物的前提條件，補料與放料策略的優化是提高產量的關鍵手段，菌體的重復利用是提升清潔生產水平的重要環節。

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Recent Progress in Semi-continuous Fermentation and Its Application

SUN Wen-jing1,2，LIU Chang-feng1,2，ZHOU Yan-zheng2,3，WANG Da-ming4，CUI Feng-jie1,2，YU Lin1,2
(1. School of Food and Biological Engineering, Jiangsu University, Zhenjiang 212013, China；2. Jiangxi Provincial Engineering and Technology Center for Food Additives Bio-production, Dexing 334221, China；3. Parchn Sodium Isovitamin C Co. Ltd., Dexing 334221, China；4. College of Life Science, Hebei Normal University, Shijiazhuang 050016, China)

Semi-continuous fermentation technology is a typical operational model. In this article, we fi rst introduced the application areas of semi-continuous fermentation, and then reviewed the classification and features of semi-continuous fermentation, its relation to continuous fermentation, and the cell recycling methods during cultivation. Finally, the prospects of semi-continuous fermentation technology were also discussed according to the recent progress on metabolic engineering and process optimization.

semi-continuous fermentation；research progress；application area；prospects

TQ920.62

A

1002-6630(2013)01-0345-06

2011-11-03

江西省科技條件平臺建設項目(2010DTZ01900)；江西省創新能力建設項目(贛發改高技字[2012]361號)；江西省優勢科技創新團隊計劃項目(贛科發計字[2010]156號)；江西省主要學科學術和技術帶頭人培養計劃項目(2008DD00600)；江蘇大學科研啟動基金項目(08JDG029)

孫文敬(1964ü)，男，研究員，博士，研究方向為生物化工。E-mail：sunwenjing1919@163.com