三聚氰胺與丙烯酰胺單體分子印跡相互作用的理論研究

劉俊渤，石 楊，孫佳妮，唐珊珊，胡耀輝，靳瑞發

(1.吉林農業大學資源與環境學院，吉林 長春 130118；2.吉林農業大學食品科學與工程學院，吉林 長春 130118；3.赤峰學院化學化工學院，內蒙古 赤峰 024000)

三聚氰胺(MEL)俗稱密胺或蛋白精，IUPAC命名為“1,3,5-三嗪-2,4,6-三氨基”，是一種三嗪類含氮雜環有機化合物，被用作化工原料。它是白色，幾乎無味，對身體有害，不可用于食品加工或食品添加物。由于MEL含氮量較高，添加到牛奶等食品中可產生蛋白質含量高的虛假現象，從而導致了中國2008年9月發生的“三鹿奶粉事件”，造成數千名食用含有MEL問題奶粉的嬰幼兒患上腎結石。因此對蛋白類食品中痕量組分MEL的分離與檢測十分重要。

分子印跡技術(MIT)是源于高分子化學、材料化學、化學工程及納米化學的交叉學科技術[1]，該技術為人們提供具有期望結構和性質的分子組合體。當體系中存在模板分子(印跡分子、目標分子)時，功能單體與交聯劑在適當溶劑中可以通過聚合使這些模板分子以互補形式固定下來，聚合后利用斷“鍵”溶劑洗脫去除模板分子，從而可獲得具有特異選擇性的分子印跡聚合(MIP)[2]。由于MIP具極高的選擇性、良好的穩定性，合成費用低，可以大批量制備等優點，近年來已在手性拆分[3]、色譜分離[4-5]、固相萃取[6-7]、天然抗體模擬[8]、模擬酶催化[9]與分子識別傳感器[10]等方面得到廣泛應用。但目前分子印跡技術領域欠缺從分子水平上探討分子印跡過程的理論研究，因此，許多研究者開始嘗試將分子模擬計算應用于分子印跡體系的理論研究，這不僅可以從分子水平上探討分子印跡和識別機理，而且可以快速篩選功能單體、印跡比例及溶劑[11-17]，提高研發效率。由于量子化學模擬計算準確度較高，所以其計算結果對于分子印跡體系的理論與實驗研究具有指導意義。

目前，MEL分子印跡材料的制備通常是以甲基丙烯酸(MAA)[18-20]、AM[21-22]和衣康酸(IA)[22]為功能單體。以往MEL分子印跡聚合物合成時都采用MAA為功能單體，但張孝剛等[22]發現AM單體與MEL之間產生的氫鍵相互作用在甲醇溶劑中對印跡體系影響最大，且對于不同功能單體相互作用的印跡機理的研究報道僅局限于傅里葉變換紅外光譜(FT-IR)、氫核磁共振波譜(1H NMR)和紫外光譜的簡單分析[22-24]，而關于在原子水平上建立分子模型用以模擬MEL與功能單體分子印跡相互作用的研究報道并未見到。因此，本實驗嘗試以MEL作為研究對象，AM為功能單體，研究MEL與AM的印跡比例不同時形成復合物的構型、成鍵情況、自然鍵軌道分析方法(NBO)電荷的變化以及反應的結合能等，表征了它們之間相互作用的強弱，探討了MEL分子印跡的作用原理，這對于優化功能單體及功能單體與印跡分子的印跡比例，提高分子印跡聚合物的穩定性、選擇性和吸附性，完善分子印跡理論都具有重要意義。

1 計算方法

圖1 MEL化學結構Fig.1 Chemical structure of MEL

采用密度泛函理論(DFT)[25-27]的pbe1pbe方法和6-31G(d,p)優化MEL幾何構型，見圖1。pbe1pbe/6-31G(d,p)水平的計算結果如表1所示，表中引用了由李雪梅等[28]所報道的MEL晶體結構數據。觀察表1數據，pbe1pbe方法的計算結果與晶體數據很接近，因此，用pbe1pbe方法優化結構比較適合。數據表明用pbe1pbe/6-31G(d,p)方法可以滿足對MEL結構優化的要求。因此，在本研究中采用pbe1pbe/6-31G(d,p)方法優化模板分子、功能單體及其聚合物的幾何構型。

表1 pbe1pbe/6-31G(d,p)方法計算的MEL分子幾何構型與實驗值對照Table 1 Structural parameters of MEL calculated at the pbe1pbe/6-31G(d,p) level and available experimental data

所有的計算均使用Gaussian 09軟件Revision A.02版，分別對印跡分子和功能單體進行以下操作：1)對MEL、AM及其復合物進行幾何構型優化，在同樣水平下進行頻率計算，得到沒有虛頻能量最低的幾何構型，并采用NBO進行電荷分析。2)研究MEL與AM功能單體在其印跡比例不同時形成的復合物氫鍵鍵長、氫鍵數目及氫鍵作用的活性位點，探討MEL與AM功能單體分子印跡的作用原理及其相互作用的強弱。3)計算MEL、AM功能單體以及其所形成復合物幾何構型的能量，利用式(1)對得到的穩定幾何構型進行結合能計算，表征MEL與AM功能單體相互作用的強弱。

在計算結合能時，基組迭加誤差(BSSE)采用Counterpoise方法(CP)消除[29]。

式中：ΔEB為CP方法校正后的相互作用能，即結合能；EC為MEL與AM功能單體分子印跡聚合物體系的總能量；ET為MEL模板分子的能量；∑EF為AM功能單體的能量之和。

2 結果與分析

2.1 MEL與AM功能單體幾何構型的優化

優化MEL和AM的分子幾何構型并計算原子的NBO電荷。模板MEL分子中有1個三嗪環及3個胺基，三嗪環上的N原子可作為質子受體，而氨基上的H原子可作為質子給體；AM分子中有1個羰基和1個氨基，其中羰基中的O原子可作為質子受體，氨基上的H原子可作為質子給體。計算結果也表明MEL分子的質子受體為三嗪環上的N2、N5、N6，質子給體為胺基上的H8、H9、H11、H12、H14、H15；AM的質子受體為羰基中的O6，質子給體為氨基上的H9、H10。MEL與AM功能單體的質子受體與質子給體位點的電荷如圖2所示。

圖2 模板分子與功能單體的構型Fig.2 Conformation of the template molecule and the functional monomer

2.2 MEL與AM功能單體復合物幾何構型的優化

根據MEL模板分子和AM功能單體分子幾何構型優化的結果，構建MEL和AM功能單體之間形成的復合物幾何構型，并通過計算模擬優化其復合物的幾何構型。通過比較模板分子與功能單體在其印跡比例不同時形成復合物的幾何構型、成鍵情況、NBO電荷的變化以及反應的結合能等，探討MEL與AM功能單體分子印跡的作用原理及其相互作用的強弱。在選擇功能單體進行計算機模擬時，分別選擇模板分子與功能單體印跡比例為1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6和1:7等7種計算模型進行研究，當印跡比例為1:7時，由于分子間存在空間位阻，模板分子與功能單體分子間斥力增大，功能單體之間相互影響，得到的復合物穩定性減弱。

2.2.1 幾何構型

圖3 模板分子與功能單體復合物的優化幾何構型Fig.3 Optimized molecular structure of MEL/AM complexes

表2 模板分子與功能單體分子印跡相互作用體系的相關參數Table 2 Bonding parameters for the interaction between MEL and AM in MIPs

MEL模板分子與AM功能單體相互作用總共得到6個穩定幾何構型，結果如圖3所示，每個穩定構型中模板分子與功能單體通過分子間氫鍵作用，其氫鍵數目、鍵長與氫鍵作用活性位點列于表2中。MEL模板分子與AM功能單體印跡比例為1:1時，兩者之間形成兩個氫鍵，其相互作用的氫鍵作用活性位點是N6┅H25—N23與N7—H9┅O21兩種形式，形成復合物后它們之間氫鍵的鍵長分別為1.904、1.846 ，這些值均在氫鍵范疇內[30-32]。由此可知，MEL與AM功能單體之間通過氫鍵相互作用。MEL模板分子與AM功能單體印跡比例為1:2、1:3、1:4、1:5時，兩者之間分別形成為4、6、8、10個氫鍵，隨著印跡比例增大，模板分子與功能單體之間形成氫鍵數目在增加，相互作用活性位點也在增多。MEL與AM印跡比例為1:6時，由圖3f優化后的幾何構型可以看出，MEL與AM功能單體之間形成12個氫鍵，其氫鍵的構成分別為N2┅H35—N33、N2┅H55—N53、N5┅H65—N63、N5┅H75—N73、N6┅H25—N23、N6┅H45—N43、N13—H15┅O21、N10—H12┅O31、N7—H9┅O41、N13—H14┅O51、N10—H11┅O61與N7—H8┅O71，氫鍵鍵長分別為1.991、1.991、1.982、2.011、1.982、2.014、1.916、1.878、1.875、1.879、1.909、1.878 。從文獻[21-22]可以看出MEL與AM的最佳印跡比例為1:3，但計算表明當MEL與AM的比例大于1:3時，它們之間的結合能絕對值仍然在增大，單體與模板分子之間的氫鍵也在增多。分子印跡聚合物制備時，印跡比例越大，活性作用位點越多，其印跡聚合物也就越規則，而規則的聚合物有助于識別模板分子與辨別其同系物，從而使聚合物有更好的吸附性與選擇性。

續表2

2.2.2 結合能

為了進一步分析MEL與AM功能單體的相互作用能，采用pbe1pbe/6-31G(d,p)方法計算了6個復合物的結合能。表3是根據式(1)模擬計算所得的MEL、AM和其復合物的能量E及經BSSE校正后的結合能ΔE。一般而言，當兩個分子相互作用時，體系的能量會減少，即形成復合物的過程是一個能量降低的過程。結合能ΔE是形成復合物后，復合物的總能量減去形成復合物的模板分子能量與每一個單體能量之和。若復合物是穩定存在的，則ΔE為負值，且ΔE越低，模板分子與功能單體形成的復合物就越穩定，印跡效應也就越強。因此，用分子模擬計算模板分子、功能單體及其之間形成復合物的能量，比較其復合物結合能的大小，可以有效篩選出印跡效果更好的功能單體與模板分子印跡的比例，減少實際實驗的時間與消耗。

表3 復合物用pbe1pbe/6-31G(d,p)方法計算的結合能Table 3 Binding energies of MEL/AM complexes calculated at the pbe1pbe/6-31G(d,p) level

由表3可知，隨著MEL與AM相互作用印跡比例的增加，其結合能ΔE絕對值越來越大。印跡分子與功能單體印跡比例1:2時比1:1時的結合能降低了51.547kJ/mol，降低了一倍左右。顯然，在模板分子與功能單體比例為1:2時，MEL與AM形成的復合物穩定性顯著增強。總體來看，當印跡比例1:6時，此時結合能最低為－281.556kJ/mol，其復合物最穩定。因此，較其印跡比例而言，MEL與AM功能單體比例為1:6時，形成的復合物穩定性最強。同時也說明分子印跡過程中印跡分子與功能單體印跡比例的選擇非常重要，這不僅影響印跡分子的鍵合速度與釋出，而且還制約著所制備的分子印跡聚合物穩定性、選擇性與吸附特性大小。

2.2.3 電荷分布

氫鍵的形成引起電子重組，這與復合物中成鍵原子的電荷轉移有關[33]。為解釋相互作用的本質，用NBO研究復合物中原子電荷，評估整體的NBO電荷轉移，從而判斷氫鍵的形成及強弱。MEL模板分子與AM功能單體印跡比例為1:1時，從MEL與AM功能單體形成復合物的NBO電荷結果可以看出：MEL與AM功能單體相互作用前，MEL結構中N6的NBO電荷為－0.643，H9的NBO電荷為0.430；相互作用后，MEL結構中N6的NBO電荷為－0.686，H9的NBO電荷為0.453。結果表明，N6失去電荷0.043，H9得到電荷0.023，MEL質子受體與質子給體發生了一定的電荷轉移，所以可以認為MEL印跡分子與AM功能單體之間發生了相互作用，形成了氫鍵。

MEL與AM功能單體印跡比例為1:2時，相互作用前，MEL結構中N2、N5的NBO電荷都為－0.643，H11、H14的NBO電荷都為0.430；相互作用后，MEL結構中N2、N5的NBO電荷分別為－0.683、－0.687，H11、H14的NBO電荷都為0.453。結果表明，N2、N5分別失去電荷0.040、0.044，H12、H14分別都得到電荷0.023。與印跡比例為1:1的復合物電荷轉移相比，增加了一個N原子質子受體和一個H質子給體，且多形成了2個氫鍵。

MEL與AM功能單體印跡比例為1:3時，相互作用前，MEL結構中N2、N5、N6的NBO電荷都為－0.643，H9、H11、H14的NBO電荷都為0.430；發生相互作用后，MEL結構中N2、N5、N6的NBO電荷都變為－0.687，H9、H11、H14的NBO電荷都變為0.454。結果表明，N2、N5、N6都失去電荷0.044，H9、H11、H14都得到電荷0.024。與印跡比例為1:2的復合物電荷轉移相比，MEL增多一個N質子受體位點及一個H質子給體位點，且多形成了2個氫鍵。

MEL與AM功能單體印跡比例為1:4時，相互作用前，MEL結構中N2、N5、N6的NBO電荷都為－0.643，H8、H9、H12、H15的NBO電荷都為0.430；發生相互作用后，MEL結構中N2、N5、N6的NBO電荷分別為－0.687、－0.684、－0.723，H8、H9、H12、H15的NBO電荷分別為0.452、0.442、0.450、0.454。結果表明，N2、N5、N6分別失去電荷0.044、0.041、0.080，H8、H9、H12、H15分別得到電荷0.022、0.012、0.020、0.024，與印跡比例為1:3的復合物電荷轉移相比，MEL的N6質子受體電荷轉移趨勢明顯增強，且多形成了2個氫鍵。

MEL與AM功能單體印跡比例為1:5時，相互作用前，MEL結構中N2、N5、N6的NBO電荷都為－0.643，H8、H9、H12、H14、H15的NBO電荷為0.430；發生相互作用后，MEL結構中N2、N5、N6的NBO電荷分別為－0.730、－0.686、－0.726，H8、H9、H12、H14、H15的NBO電荷分別為0.452、0.447、0.451、0.444、0.449。結果表明，N2、N5、N6分別失去電荷0.087、0.043、0.083，H8、H9、H12、H14、H15分別得到電荷0.022、0.017、0.021、0.014、0.019。與印跡比例為1:4的復合物電荷轉移相比，MEL的N2質子受體轉移電荷趨勢明顯增強，且多形成了2個氫鍵。

MEL與AM功能單體印跡比例為1:6時，作用前，MEL結構中N2、N5、N6的NBO電荷都為－0.643，H8、H9、H11、H12、H14、H15的NBO電荷都為0.430；發生相互作用后，MEL結構中N2、N5、N6的NBO電荷分別為－0.731、－0.730、－0.730，H8、H9、H11、H12、H14、H15的NBO電荷分別為0.449、0.450、0.446、0.448、0.449、0.446。結果表明，N2、N5、N6分別失去電荷0.088、0.087、0.087，H8、H9、H11、H12、H14、H15分別得到電荷0.019、0.020、0.016、0.018、0.019、0.016。與印跡比例為1:5的復合物電荷轉移相比，MEL的N5質子受體轉移電荷趨勢明顯增強，且多形成了2個氫鍵。因此，較其他印跡比例，MEL與AM功能單體比例為1:6時，形成的氫鍵相互作用力最強。從這些值可以判斷，電荷轉移量的大小順序與結合能順序是一致的。

3 結 論

以MEL為印跡分子，以AM為功能單體，采用量子化學計算通過比較印跡分子與功能單體在其不同印記比例時形成復合物的構型、成鍵情況、NBO電荷的變化及反應的結合能，探討MEL與AM功能單體分子印跡的作用原理及其相互作用的強弱。通過計算機輔助計算分析研究表明，模板分子與功能單體印跡比例為1:6時，電荷轉移趨勢總體最大，其復合物的結合能最低，印跡復合物體系作穩定，其氫鍵作用的活性位點與形式分別是兩個N2┅H—N、兩個N5┅H—N、兩個N6┅H—N、兩個N7—H┅O、兩個N10—H┅O與兩個N13—H┅O。因此，對MEL模板分子，制備具有較高選擇性和吸附能力的分子印跡聚合物其印跡分子與AM功能單體最佳印跡比例為1:6。通過模擬計算，有助于指導分子印跡聚合物合成時功能單體及功能單體與印跡分子最佳印跡比例的選擇，減少了實際實驗過程中的時間及消耗，更為完善分子印跡作用的原理提供系統的理論研究。

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