草質素體外清除自由基及抑制蛋白質氧化的作用

喬 燕，劉學波*

(西北農林科技大學食品科學與工程學院，陜西 楊凌 712100)

活性氧(ROS)是需氧有機體細胞正常代謝所伴隨的副產物，正常生物體具有維持活性氧平衡生理濃度的功能，但當機體內過多的ROS與抗氧化物質不足同時存在時，機體將處于一種不平衡代謝狀態，造成機體氧化應激而損傷生物大分子，如蛋白質、核酸和脂類等，引起其結構和功能的改變，最終導致機體生理和病理的改變[1]。蛋白質占細胞和組織干質量的68%，是生物功能的主要體現者，因此成為ROS在生物體內的主要攻擊標靶[2]。從生化機制方面來看，ROS可以通過直接誘導蛋白質主鏈和側鏈氧化，也可通過脂質過氧化和糖基化等過程間接誘導蛋白質氧化，而蛋白質羰基化則是蛋白質直接和間接氧化的結果之一，是蛋白質分子被自由基氧化修飾的一個重要標記[3]。研究表明，蛋白質的氧化損傷可造成許多重大疾病，如帕金森(PD)、阿爾茨海默(AD)和肌萎縮側索硬化(ALS)等衰老相關疾病[4]，腫瘤[5]及其他疾病[6]。因此抗氧化劑的開發以及對機體生物大分子的保護成為國內外研究的熱點。近年，大量研究已證實，黃酮類物質，如黃芩黃素、黃芩苷、槲皮素、假荊芥屬苷等[7-11]，具有較強清除自由基的能力及抗衰老、抗癌、消炎、抑制糖尿病并發癥等功能。

草質素(herbacetin)是3,4’,5,7,8-五羥基取代的黃酮類物質(圖1)，主要存在于筆筒草、紅景天、棉花等植物中[12-13]。目前，國內外鮮有對草質素生物活性及藥理活性的研究報道，而研究表明，酚羥基官能團的位置及個數對抗氧化性起重要的作用[14-15]，鑒于草質素的結構中含有5個酚羥基，推測其可能具有較強的體外抗氧化性[16]。因此本實驗擬初步探討草質素清除自由基及預防蛋白氧化、減少蛋白羰基化，以期為草質素在天然抗氧化劑和功能性食品領域的開發應用提供依據。

圖1 草質素結構Fig.1 Chemical structure of herbacetin

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

草質素(純度＞98%) 上海永恒生物技術有限公司；牛血清白蛋白(BSA)、2,2-偶氮二(2-甲基丙基咪)二鹽酸鹽(AAPH)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)美國Sigma公司；Anti-DNP、Anti-Rabbit 美國Santa Cruz公司；噻唑蘭(MTT)、2,4-二硝基苯肼(DNPH) 美國Amresco公司。

1.2 儀器與設備

680酶標儀、165-8001垂直電泳槽 美國Bio-Rad公司；QYC110臺式恒溫振蕩器 上海福瑪公司；AUY220萬分之一天平 日本島津公司；微量移液槍德國Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 試劑配制

草質素溶液(50mmol/L)：稱取草質素粉末0.00302g，溶于200μL甲醇(純度95.5%)中，－20℃避光保存，用甲醇稀釋成不同濃度的草質素工作液。

DDPH溶液(1mmol/L)：稱取0.00786g DPPH溶于20mL 甲醇(純度95.5%)，避光保存。

DNPH溶液(20mmol/L)：0.39628g DNPH溶于100mL 0.2mol/L HCl中，避光保存。

1.3.2 DPPH自由基清除能力測定

參考Mishra等[17]的方法略有改動。向離心管中加入49μL甲醇及1μL不同濃度的草質素溶液，再分別加入50μL DPPH溶液，混合均勻，室溫下避光反應30min，點樣于96孔板，517nm波長處測定吸光度，記為Ai；同時以99μL的甲醇與1μL草質素溶液混合后的吸光度記為Aj；以50μL的DPPH溶液與50μL的甲醇混合后的吸光度記為A；以100μL甲醇的吸光度記為A0。DPPH自由基清除率計算如公式(1)。

1.3.3 羥自由基(·OH)清除能力測定

參照陳金娥等[18]的方法略有改動。向離心管中加入96μL超純水、4μL不同濃度草質素溶液以及100μL 6mmol/L FeSO4、100μL 2.4mmol/L H2O2溶液，混合均勻，在室溫下靜置10min，再加入100μL水楊酸，37℃水浴反應30min，點樣于96孔板，510nm波長處測定吸光度，記為Ai；同時以296μL超純水與4μL甲醇、100μL 6mmol/L水楊酸混合后的吸光度記為A。羥自由基清除率計算如公式(2)。

1.3.4 Cu2+/H2O2誘導BSA蛋白氧化損傷

向離心管中加入97μL BSA蛋白溶液(本反應體系BSA蛋白溶液質量濃度均為0.6mg/mL)和1μL草質素溶液，混合均勻，室溫孵育30min，再分別加入1μL 100 mol/L Cu2+和2.5mmol/L H2O2，37℃水浴90min；同時以97μL BSA蛋白溶液與1μL甲醇、2μL 10mmol/L PB緩沖液(pH 6.0)混合液作為陽性對照；以97μL BSA蛋白溶液、1μL甲醇、1μL Cu2+和1μL H2O2(Cu2+和H2O2的濃度同上)的混合液作為陰性對照。反應結束后，加入25μL SDS，95℃水浴5min，使蛋白充分變性。同體積的蛋白樣品經10%聚丙烯凝膠電泳后，0.15%的考馬斯亮藍R-250染色30min，脫色過夜，蛋白含量由Quantity One 4.6.2軟件分析。草質素對Cu2+/H2O2誘導BSA蛋白氧化損傷的保護率計算如公式(3)。

式中：ρ表示Cu2+/H2O2單獨處理后，剩余BSA蛋白密度；ρi表示不同濃度草質素預處理，再經Cu2+/H2O2處理后，剩余BSA蛋白密度。

1.3.5 Cu2+/H2O2誘導BSA蛋白羰基化

將1.3.4節中制備好的蛋白樣品經10%聚丙烯凝膠電泳后，10V 25min轉印，使凝膠上的蛋白轉移到PVDF膜上。膜再與DNPH溶液衍生30min，2mol/L HCl洗滌3次，每次5min，甲醇洗滌5次，每次5min。5%脫脂乳室溫封閉2h，TBST洗滌。用抗DNP抗體4℃孵育過夜，TBST洗滌，Anti-Rabbit抗體室溫孵育2h，TBST洗滌，化學成像系統檢測蛋白質羰基化的產生。草質素對Cu2+/H2O2誘導BSA蛋白羰基化的抑制率計算如公式(4)。

式中：ρ表示Cu2+/H2O2單獨處理后，剩余BSA蛋白密度；ρi表示不同濃度草質素預處理，再經Cu2+/H2O2處理后，剩余BSA蛋白密度。

1.3.6 AAPH誘導BSA蛋白氧化損傷

向離心管中加入50μL BSA蛋白溶液(本反應體系中BSA蛋白溶液質量濃度均為1.2mg/mL，PB濃度同上)，1μL草質素溶液和29μL PB溶液，混合均勻，室溫孵育30min，再分別加入20μL 500mmol/L AAPH溶液，37℃反應6h；同時以50μL BSA蛋白溶液、1μL甲醇及49μL PB混合液作為陽性對照組；以50μL BSA蛋白溶液、1μL甲醇、29μL PB和20μL 500mmol/L AAPH的混合液作為陰性對照。反應結束后，加入25μL SDS，95℃反應5min，使蛋白充分變性。同體積的蛋白樣品經10%聚丙烯凝膠電泳后，0.15%的考馬斯亮藍R-250染色30min，脫色過夜，蛋白含量由Quantity One 4.6.2 軟件分析。

1.3.7 AAPH誘導BSA蛋白羰基化

將1.3.5節中制備好的蛋白樣品經10%聚丙烯凝膠電泳后，10V 25min轉印，使凝膠上的蛋白轉移到PVDF膜上。膜再與DNPH衍生30min，2mol/L HCl洗滌3次，每次5min，甲醇洗滌5次，每次5min。5%脫脂乳室溫封閉2h，TBST洗滌。用抗DNP抗體4℃孵育過夜，TBST洗滌，Anti-Rabbit抗體室溫孵育2h，TBST洗滌，化學成像系統檢測蛋白質羰基化的產生。

1.4 數據處理

所有實驗數據用Microsoft Excel 2007處理，DPS 7.05軟件進行統計學分析，顯著水平P＜0.05。

2 結果與分析

2.1 草質素對DPPH自由基清除能力

圖2 草質素對DPPH自由基清除的作用Fig.2 Scavenging effect of herbacetin on DPPH radical

由圖2可知，不同濃度草質素對DPPH自由基均有顯著的清除作用。在濃度10～100μmol/L的范圍內，草質素對DPPH自由基的清除率隨著其濃度增大而增大，依次為19.14%、32.00%、56.98%、83.22%，其IC50值為49.28μmol/L，即14.88μg/mL。與江巖等[19]測定的VC清除DPPH自由能力相比(IC50=4.09μg/mL)，草質素清除DPPH自由基能力略弱于VC。

2.2 草質素對·OH清除能力

由圖3可知，草質素能夠顯著地清除·OH，在10～50μmol/L濃度范圍內，其清除能力沒有明顯變化。濃度為100、250、500μmol/L時，清除率分別達到35.97%、52.66%、62.61%，其清除·OH的IC50值為219.20μmol/L，即66.20μg/mL，參照郭松年[20]的研究可知，草質素清除·OH的能力略高于VC(IC50=89μg/mL)。由清除DPPH自由基和·OH的IC50值可知，草質素清除DPPH自由基的能力明顯強于·OH，而VC清除DPPH自由基的能力強于草質素，清除·OH的能力略低于草質素。

圖3 草質素對羥自由基清除的作用Fig.3 Scavenging effect of herbacetin on hydroxyl radical

2.3 草質素對Cu2+/H2O2誘導的BSA蛋白氧化損傷的保護作用

圖4 草質素對Cu2+/H2O2誘導的BSA蛋白氧化損傷的保護作用Fig.4 Protective effect of herbacetin against oxidative damage of BSA induced by Cu2+/H2O2

由圖4可知，不同濃度草質素均可顯著保護Cu2+/H2O2誘導的BSA蛋白氧化損傷。Cu2+催化H2O2產生的·OH可顯著的誘導BSA蛋白損傷，經過不同濃度的草質素處理后，可保護蛋白免受·OH的氧化，其保護率分別為55.00%、112.00%、139.00%和252.00%。

2.4 草質素對AAPH誘導的BSA蛋白氧化損傷的保護作用

由圖5可知，濃度在10～100μmol/L范圍內，草質素均可顯著保護AAPH誘導的BSA蛋白氧化損傷。AAPH經熱分解產生以碳為中心的自由基，在氧氣的參與下，進一步生成·OOH而導致BSA蛋白發生氧化損傷[21]，而草質素可防止蛋白損傷。當濃度達到100μmol/L時，其對AAPH誘導的BSA蛋白損傷的保護作用已接近未經AAPH處理組。

圖5 草質素對AAPH誘導的BSA蛋白氧化損傷的保護作用Fig.5 Protective effect of herbacetin against oxidative damage of BSA induced by AAPH

2.5 草質素對Cu2+/H2O2誘導的BSA蛋白羰基化的抑制作用

圖6 草質素對Cu2+/H2O2誘導的蛋白羰基化的抑制作用Fig.6 Inhibition effect of herbacetin on Cu2+/H2O2-induced protein carbonylation

由圖6可知，草質素可抑制Cu2+/H2O2誘導的BSA蛋白羰基化，50、100μmol/L草質素能顯著抑制蛋白質羰基化的發生，抑制率分別為21%、50%。但10、25μmol/L組的抑制作用不明顯，原因可能是低濃度草質素清除羥自由基的能力較弱，還不能防止羥自由基對蛋白側鏈氨基酸的攻擊。

2.6 草質素對AAPH誘導的BSA蛋白羰基化的抑制作用

由圖7可知，經AAPH處理后，也可顯著地誘導BSA發生羰基化，不同濃度的草質素前處理，均可抑制羰基化的發生，且隨著草質素濃度的增加，羰基化的程度逐漸減弱。濃度為25、50、100μmol/L時，羰基化程度與AAPH組相比分別降低了1.2、2.1倍和2.9倍。

圖7 草質素對AAPH誘導的蛋白羰基化的抑制作用Fig.7 Inhibition effect of herbacetin on AAPH -induced protein carbonylation

3 結 論

蛋白質是生物體的重要組成成分，在生命活動中擔負著重要功能。其側鏈的賴氨酸、精氨酸、脯氨酸和蘇氨酸等殘基易受自由基攻擊而發生蛋白氧化損傷，蛋白質羰基化則是蛋白質的氨基酸殘基受到攻擊而生成的NH3和相應羰基衍生物，其含量的多少間接反應了蛋白質的氧化損傷程度[22-25]。本研究通過對DPPH自由基和·OH清除能力的測定，表明草質素能顯著清除這兩種自由基，但清除DPPH自由基的能力要強于·OH。當BSA蛋白用Cu2+/H2O2或AAPH處理后，可顯著的誘導BSA蛋白氧化及羰基化，原因在于Cu2+催化H2O2產生的·OH和AAPH產生的·OOH自由基攻擊蛋白質，而導致蛋白質氨基酸殘基被修飾，分子構象的改變[26-28]。本研究發現，草質素可使蛋白氧化及羰基化的程度降低，原因可能是草質素能清除自由基，阻止了自由基鏈式反應導致的對蛋白質的氧化攻擊。

綜上所述，草質素可顯著清除自由基及防止蛋白發生氧化。該研究為草質素預防某些與蛋白氧化損傷有關的疾病及功能性食品的開發提供了一定的理論依據。然而，有關草質素藥理及病理活性尚不清楚，還需進一步深入。

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