火棘果紅色素的提取及抗氧化活性

李鵬霄，茆廣華，趙 婷，鄒 燁，任月娜，白石琦，吳向陽，仰榴青,*

(1.江蘇大學藥學院，江蘇 鎮江 212013；2.江蘇大學食品與生物工程學院，江蘇 鎮江 212013；3.江蘇大學化學化工學院，江蘇 鎮江 212013)

火棘(Pyracantha fortuneana)別名赤陽子、葉祥果、火把果、紅果、救軍糧等，是薔薇科火棘屬植物，在我國華東、華中及西南地區均有種植。火棘果中含有豐富的營養物質，具有很高的食用和藥用價值，是加工食品，提取天然色素、化妝品添加劑的重要野生資源；火棘果果皮中含有花色苷[1-3]。研究發現，花色苷具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎、抗病毒、保肝、調節心腦血管及神經系統等多種藥理活性，且具有較好的著色效果，在食品和化妝品行業有著廣泛的應用[4-8]?；鸺t色素是從火棘果中提取得到的一種水溶性色素，屬花色苷類，具有良好的熱穩定性和耐光性，用途廣泛[9-10]。本實驗從干燥火棘果中提取火棘果紅色素，采用C18Sep-Pak柱對提取物進行初步純化，并研究純化產物的抗氧化活性，以期為火棘果紅色素的開發利用提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

天然火棘果，江蘇大學校園內采集，經鑒定為薔薇科火棘屬植物火棘Pyracantha fortuneana的果實，于通風處陰干后，用烘箱烘干，并保存于干燥器中備用。

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、福林-酚試劑(FC)美國Sigma公司；雙氧水、水楊酸、氯化鉀、醋酸鈉、濃鹽酸、蒽酮、濃硫酸、硫酸亞鐵、三羥甲基氨基甲烷、鄰苯三酚、無水乙醇、冰醋酸等均為分析純 上海國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

C18Sep-Pak柱 美國Waters公司；BS 124S分析天平北京賽多利斯儀器有限公司；DHG-9140A型電熱恒溫鼓風干燥箱 上海一恒科學儀器有限公司；VIS-7220可見分光光度計 北京瑞利分析儀器公司；TU-1800紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；UV-2450型紫外-可見分光光度計 日本島津公司；RE-52C旋轉蒸發器 鞏義市予華儀器有限責任公司；SHZ-D(Ⅲ)循環水式真空泵 鞏義市英峪予華儀器有限責任公司。

1.3 方法

1.3.1 火棘果紅色素的提取及純化

1.3.1.1 火棘果紅色素提取[11]

干燥火棘果用70%乙醇(pH3，HCl)于溫度40℃、物料比1:9(m/V)條件下，浸提3次，每次提取40min，過濾提取液，合并濾液，于50℃條件下減壓濃縮，得火棘果紅色素浸膏PFE(得率30.3%)，4℃冰箱保存備用。

1.3.1.2 C18Sep-Pak柱純化火棘果紅色素[12]

C18Sep-Pak柱用10mL甲醇活化后，用含0.01%鹽酸的水溶液平衡。取1.0g PFE用含0.01%鹽酸的水溶液溶解后，上樣，用約2000mL的0.01%的酸水洗脫，流出液棄去。用甲醇將富集在C18Sep-Pak柱上的色素洗脫至無色。收集的甲醇洗脫液，于30℃濃縮至干后，即得純化產物PPFE(得率0.55%)，4℃冰箱保存備用。

1.3.2 火棘果中活性成分的含量測定

分別稱取10g PFE及1g PPFE，用蒸餾水定容至100mL后用于花色苷、總酚及總糖含量的測定。

1.3.2.1 花色苷含量測定

采用pH示差法[13]測定提取物花色苷含量。準確吸取PFE及PPFE水溶液各1mL，分別用pH1.0和pH4.5的緩沖液定容至10mL，并分別平衡50min和80min，以蒸餾水作空白，測定其在530nm和700nm波長處的吸光度，按式(1)計算花色苷含量。

式中：A=(A530nm－A700nm)pH1.0－(A530nm－A700nm)pH4.5；ε為為矢車菊花素-3-葡萄糖苷的消光系數(26900L/(cm·mol))；DF為稀釋因子；Mw為矢車菊花素-3-葡萄糖苷的相對分子質量(449.4)；V為最終體積/mL；m為產品質量/mg；L為光程(1cm)。

1.3.2.2 總酚含量測定

采用福林-肖卡爾法(FC法)[14]。精密稱取105℃干燥至恒質量的沒食子酸10mg，用蒸餾水溶解并定容到10mL。精密吸取沒食子酸溶液0.1、0.25、0.5、0.75、1mL于25mL容量瓶中，加蒸餾水定容，配成10、25、50、75、100 g/mL不同質量濃度的沒食子酸標準溶液。準確吸取1mL不同質量濃度的沒食子酸溶液，加入1.0mL 0.1mol/L FC試劑，充分混勻后，放置5min，再加入1.5mL 7.5g/100mL Na2CO3溶液，混勻后，顯色反應2h，于765nm波長處測定吸光度，另以蒸餾水代替樣品液作為空白對照。以沒食子酸質量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，制作標準曲線。得到沒食子酸的標準曲線方程為：y= 0.0344x＋0.0968(R2=0.9986)。

準確吸取PFE及PPFE溶液1.0mL，按照上述方法，于765nm波長處測定樣品液的吸光度，根據標準曲線，以每100g樣品中沒食子酸的毫克數計算總酚的含量。

1.3.2.3 總糖含量測定

總糖含量測定采用蒽酮比色法[15]。標準曲線的繪制：配制質量濃度為0、10、20、30、40、60、80 g/mL的系列葡萄糖標準溶液，取1.0mL試液放入具塞試管中，加入蒽酮試劑4.0mL，迅速浸于冰水浴中冷卻，各管加完后一起浸入沸水浴中10min，取出，冰浴中冷卻，在620nm波長處測定A，以不加樣品為空白，以標準糖含量(μg)為橫坐標，以吸光度A為縱坐標，繪標準曲線，得到葡萄糖的標準曲線方程為：y=0.0118x－0.007(R2=0.9998)。

樣品測定：配制質量濃度為0.2mg/mL的PFE及PPFE水溶解，按上述方法進行操作，測定其在620nm波長處的A，代入標準曲線以每100g樣品中葡萄糖的含量按式(2)計算計算總糖含量。

式中：C為含糖量/ g；m為樣品質量/g；V總為樣品總體積/mL；V測為測定樣品體積/mL；n為稀釋倍數。

1.3.3 PPFE體外抗氧化活性測定

1.3.3.1 清除·OH的能力測定[16-17]

利用H2O2與Fe2+混合發生Fenton反應，生成具有很高反應活性的·OH，在體系內加入水楊酸捕捉·OH并產生有色產物，該物質在510nm波長處有最大吸收?？寡趸瘎┘尤牒螅c水楊酸競爭，從而使有色產物生成量減少，減弱產物在波長510nm處的吸收峰。

依次將6mmol/L的FeSO4溶液、樣品溶液、H2O2溶液各2mL加入試管中，搖勻，靜置10min；加入6mmol/L水楊酸2mL，搖勻，靜置30min，于510nm波長處測定吸光度，以抗壞血酸(VC)作為陽性對照。樣品溶液為色素溶液時測得的吸光度為Ai，樣品溶液為蒸餾水時測得的吸光度為A0，用蒸餾水代替水楊酸測得的吸光度為Aj。按照式(3)計算清除率。

取0.05mol/L的Tris-HCl緩沖液(pH8.2)4.5mL，25℃水浴中預熱20min，依次加入樣品溶液和0.4mmol/L鄰苯三酚溶液各1mL，混勻，于25℃水浴中反應5min，加入8mol/L的HCl溶液1mL，以Tris-HCl緩沖液作為參比，于325nm波長處測定其吸光度，以VC作為陽性對照。樣品溶液為色素溶液時測得的吸光度(Ai)，樣品溶液為蒸餾水時測得的吸光度(A0)，用蒸餾水代替鄰苯三酚溶液測得的吸光度為Aj。按照式(4)計算清除率。

1.3.3.3 清除DPPH自由基的能力測定[20-21]

取樣品溶液2mL于試管中，加入2×10-4mol/L的DPPH乙醇溶液2mL，混勻，暗處反應30min后于517nm波長處測定其吸光度，以VC作為陽性對照。樣品溶液為色素溶液時測得的吸光度為Ai，樣品溶液為蒸餾水時測得的吸光度為A0，用乙醇代替DPPH乙醇溶液測得的吸光度為Aj。按照式(5)計算清除率。

1.4 數據處理

平行實驗為3次重復，數據處理采用軟件SPSS 16.0版(SPSS Inc., Chicago, USA)ANOVA統計分析，數據用±s表示。

2 結果與分析

2.1 PFE及PPFE中花色苷、總酚及總糖含量

圖1為pH3條件下火棘果紅色素提取液的吸收光譜，在400～800nm波長范圍內火棘果紅色素提取液在530nm和656nm波長處有吸收峰，其中530nm波長處的吸收峰為火棘果紅色素的吸收峰。

PFE、PPFE中花色苷、總酚及總糖含量如表1所示。火棘果紅色素提取液通過C18Sep-Pak柱后，花色苷及總酚含量增高，總糖未檢出，表明C18Sep-Pak柱除糖效果好，且具有富集花色苷和總酚的作用。

圖1 火棘果紅色素提取液的吸收光譜圖(400～800nm)Fig.1 Absorption spectrum of pyracantha red pigment (400 to 800 nm)

表1 PFE、PPFE中花色苷、總酚及總糖含量Table 1 Contents of anthocyanins, total phenols and total sugar in the crude extract and the purified product

2.2 PPFE體外抗氧化活性

2.2.1 清除·OH能力

圖2 PPFE的·OH清除活性Fig.2 Radical scavenging capacity of the purified red pigments on hydroxyl free radical

由圖2可知，隨著PPFE和VC質量濃度的增大清除效果逐漸增強，在質量濃度為2.0mg/mL時，PPFE和VC的清除率分別為61.04%、100%；在該體系中的半抑制質量濃度IC50分別為1.43mg/mL和0.43mg/mL。

圖3 PPFE的 ·清除活性Fig.3 Radical scavenging capacity of the purified red pigments on superoxide anion free radical

由圖3可知，清除率隨著PPFE和VC質量濃度的增加而增大，但PPFE清除率變化幅度小于VC，PPFE和VC在該體系中的半抑制質量濃度IC50分別為3.13mg/mL和0.22mg/mL。

2.2.3 清除DPPH自由基能力

圖4 PPFE的DPPH自由基清除活性Fig.4 Radical scavenging capacity of the purified red pigments on DPPH free radical

由圖4可知，清除率隨著PPFE和VC質量濃度的增加而增大，在相同質量濃度時，PPFE的清除率略低于VC。PPFE和VC在該體系中的半抑制質量濃度IC50分別為3.43 g/mL和1.67 g/mL。

3 結 論

在本實驗條件下，火棘果紅色素粗提物中花色苷含量為1.16mg/100g、總酚含量為2.18mg/100g、總糖含量為1095.34mg/100g；通過C18Sep-Pak柱純化后，花色苷含量增高至20.61mg/100g，總酚含量增高至48.62mg/100g，總糖未檢出，說明C18Sep-Pak柱除糖效果好，且具有富集花色苷和總酚的作用?？寡趸钚詼y定結果表明，火棘果紅色素純化物對DPPH自由基、·OH與·均有較強的清除作用，尤以對DPPH自由基的清除作用最強。

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