瑞士乳桿菌X-脯氨酰-二肽酰基-氨基肽酶的分離純化及酶學性質

郭宇星，祝 倩，朱 坤，周慧敏，孫楊贏,2，曾小群,2，潘道東,2,*

(1.南京師范大學金陵女子學院，江蘇 南京 210097；2.寧波大學海洋學院，浙江 寧波 315211)

血管緊張素轉化酶(ACE)抑制肽是一類氨基酸序列和肽鏈長度各不相同的多肽，具有降低血壓的功效，在功能性食品的開發中，逐漸已成為研究熱點[1-2]。已有較多關于利用瑞士乳桿菌(Lactobacillus helveticus)發酵法制備ACE抑制肽的報道，因為瑞士乳桿菌相比于其他乳酸菌具有較強的蛋白水解能力，制作的酸乳中含有高活性的ACE抑制肽[3-4]。瑞士乳桿菌能夠水解乳蛋白產生ACE抑制肽，與其蛋白水解系統有關，瑞士乳桿菌蛋白水解系統包括細胞壁蛋白酶(CEP)，其作用是把蛋白質水解成一系列的寡肽，然后由寡肽轉運體(Opp A)、二肽和三肽轉運體(Dtp P和Dtp T)運輸至細胞內，由胞內肽酶(包括肽鏈內切酶、氨肽酶、二肽三肽酶、Pro-特異性肽酶)進一步將短肽水解為氨基酸或更小的肽類[5-8]。ACE抑制肽在水解過程中產生，但ACE抑制肽具體由哪種酶特異性水解乳蛋白產生尚不清楚。

從以往的報道看，ACE抑制肽的蛋白(Pro)含量高，含Pro的ACE抑制肽的活性要高于不含Pro的ACE抑制肽[9]。比如，1995年，Nakamura等[10-11]用Lactobacillushelveticus和Saccharomyces cerevisiae制作了一種Calpis酸乳飲料，然后進行動物實驗，發現原發性高血壓小鼠(SHR)長期服用Calpis后，可抑制血壓上升，隨后研究人員從Calpis中提取出兩種具有ACE抑制活性的多肽VPP和IPP，證明這兩種肽具有降血壓功能。Pan等[12]用Lactobacillus helveticusJCM1004水解乳蛋白，鑒定出了2個ACE抑制肽，為IPP和VPP。1999年，Yamamoto等[13]從Lactobacillus helveticusCPN4發酵的酸奶產品中找到了1條有抗高血壓活性的二肽：Tyr-Pro。在乳蛋白中Pro含量較多，在αs1-CN中Pro含有8.5%，在β-CN中Pro含有16.7%[5]。瑞士乳桿菌肽酶中，Pro-特異性肽酶可特異性地水解含有Pro的肽鍵，瑞士乳桿菌X-脯氨酰-二肽酰基-氨基肽酶(X-prolyl-dipeptidyl aminopeptidase，Pep X)為Pro特異性肽酶的一種，主要水解多肽釋放出X-Pro二肽。因此，本實驗擬提取瑞士乳桿菌Pep X，并進行分離純化，研究其酶學性質，以期能全面了解酶的性質，為后期研究瑞士乳桿菌蛋白酶特異性水解乳蛋白產生ACE抑制肽及ACE抑制肽的開發提供一定的研究基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

瑞士乳桿菌ATCC 15019(Lactobacillus helveticusATCC 15019) 美國模式培養物集存庫(American type culture collection)；H-Gly-Pro-pNA·p-tosylate 瑞士巴亨公司；Sephacryl S-300 HR 美國Pharmacia公司；SDSPAGE低分子質量標準蛋白質、聚乙二醇20000 南京金慶祥貿易有限公司。

1.2 儀器與設備

生化培養箱 廣東醫療儀器廠；PHS-3C精密pH計上海雷磁儀器廠；紫外-可見分光光度計 上海棱光技術有限公司；CL-22M高速冷凍離心機 賽特湘儀離心機儀器有限公司；超聲波細胞破碎儀 寧波新芝生物科技股份有限公司；DYCZ-24DN型迷你雙垂直電泳儀(槽)北京市六一儀器廠；分離層析裝置 上海滬西分析儀器廠有限公司。

1.3 方法

1.3.1 瑞士乳桿菌菌體制備

取瑞士乳桿菌ATCC 15019凍干粉接種于液體MRS培養基，連續活化3代。然后進行擴大培養，培養條件為37℃，生長對數期取出后4℃、4500r/min離心20min，收集菌體。菌體用50mmol/L Tris-HCl(pH7.1)緩沖液洗滌，4℃、4500r/min離心20min后棄上清液，收集菌體。重復洗滌3次后，收集瑞士乳桿菌菌體備用。

1.3.2 超聲波破碎菌體提取Pep X粗酶液

瑞士乳桿菌菌體用50mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH7.1)重新懸浮后進行超聲波破碎。菌體與緩沖液的比例為1:42(m/V)。超聲波破碎條件為功率300W，破碎時間為26min(工作時間3s，間隔時間5s)，冰浴冷卻。超聲波破碎后4℃、4500r/min離心20min，取上清液，即為粗酶液。

1.3.3 Pep X活性測定

H-Gly-Pro-pNA·p-tosylate為Pep X的底物。取0.02mL配制成16.4mmol/L的H-Gly-Pro-pNA· p-tosylate、酶液1mL、50mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH7.1)2mL混合，在37℃條件下保溫2h后取出，在410nm波長處測定吸光度?？瞻讓φ展苁且哉麴s水代替酶液同樣條件操作。酶活定義為：在37℃時，每小時吸光度上升0.01為1個活力單位。

1.3.4 蛋白質含量測定

采用考馬斯亮藍法測定蛋白質含量[14]。

1.3.5 Pep X的分離純化

1.3.5.1 硫酸銨分級沉淀

將按1.3.2節步驟制取的粗酶液進行預冷，預冷溫度至0～5℃，然后緩慢加入40%碾細的硫酸銨。4℃靜置過夜后再于4℃、6000r/min離心20min，收集沉淀，上清液再加入60%硫酸銨，4℃靜置過夜，離心后收集沉淀，按以上步驟操作，分別獲得40%、60%、80%、100%硫酸銨的沉淀。沉淀利用透析進行除鹽，透析袋截留分子質量為14000D，除鹽后樣品用聚乙二醇20000濃縮，然后測定每級硫酸銨沉淀的蛋白含量和Pep X酶活性。

1.3.5.2 Sephacryl S-300 HR分離

選用的層析柱為1.6cm×50cm，硫酸銨沉淀后酶液樣品上樣量為3mL，蒸餾水洗脫，流速20mL/h，5min收集1管。采用上海滬西核酸蛋白檢測系統檢測，紫外檢測器波長為280nm。按照圖譜收集組分，各組分分別測定酶活性及蛋白含量。

1.3.6 非變性-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)法切膠制備Pep X

1.3.6.1 酶譜法確定Pep X條帶

非變性-PAGE電泳中分離膠與濃縮膠制備方法參考文獻[15]進行。

a板：在10%分離膠中加入1%的Pep X的底物H-Gly-Pro-pNA·p-tosylate，5%濃縮膠。上樣樣品Sephacryl S-300 HR分離的酶液后進行非變性-PAGE電泳，電泳完畢后在50mmol/L Tris-HCl(pH7.1)緩沖液中37℃保溫24h，讓酶與底物充分反應。保溫完畢后用考馬斯亮藍R-250染色2h，充分脫色。b板：不加H-Gly-Pro-pNA·p-tosylate，電泳條件同上。a板與b板的條帶作對比，a板上消失的蛋白帶即為Pep X。

1.3.6.2 切膠回收Pep X

經1.3.6.1節確定Pep X條帶后，切下b板上相應的Pep X酶條帶，把膠充分碾碎后加入50mmol/L Tris-HCl(pH7.1)緩沖液過夜后4000r/min離心15min，取上清液，重復制備至后續實驗所需的酶量。上清液冷凍干燥后即為純化的Pep X。純化的Pep X測定分子質量及研究其酶學性質。

1.3.7 SDS-PAGE測定酶分子質量

[15]進行，蛋白Marker選用低分子質量標準蛋白質。

1.3.8 Pep X酶學性質研究

1.3.8.1 Pep X最適pH值測定

用pH值分別為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0的50mmol/L Tris-HCl緩沖液溶解Pep X，然后按照1.3.3節測定酶活。

1.3.8.2 Pep X最適溫度測定

用50mmol/L Tris-HCl(pH7.1)緩沖液溶解Pep X，在28、33、37、41、45℃條件下保溫2h測定酶活。

1.3.8.3 Pep X的pH值穩定性

用pH值分別為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0的50mmol/L Tris-HCl緩沖液溶解Pep X，保溫1h，然后測定酶活。

1.3.8.4 Pep X的熱穩定性

用50mmol/L Tris-HCl(pH7.1)緩沖液溶解Pep X，然后在25、35、45、55、65、75、85℃條件下保溫1h，取出后測定酶活。

1.3.8.5 蛋白酶抑制劑和金屬離子對酶活力的影響

用50mmol/L Tris-HCl(pH7.1)緩沖液溶解Pep X，分別加入1mmol/L和10mmol/L的金屬離子，包括Ca2+、Ba2+、Co2+、Zn2+、Ni2+、Mn2+、Fe3+、K+、Na+，1mmol/L和10mmol/L的蛋白酶抑制劑苯甲基磺酰氟(PMSF)和EDTA。在37℃孵浴2h后，測定酶活。

2 結果與分析

2.1 Pep X的分離純化

2.1.1 硫酸銨分級沉淀

表1 (NH4)2SO4飽和度對Pep X提取的影響(±s)Table 1 Effect of (NH4)2SO4 saturation degree on the purification of Pep X (±s)

表1 (NH4)2SO4飽和度對Pep X提取的影響(±s)Table 1 Effect of (NH4)2SO4 saturation degree on the purification of Pep X (±s)

硫酸銨飽和度/% 0～40 40～60 60～80 80～100 Pep X酶活力/(U/mL) 22.18±0.35 18.20±0.30 4.60±0.06 2.90±0.15 Pep X酶比活力/(U/mg) 9.52±0.15 7.65±0.13 1.82±0.02 1.30±0.07沉淀蛋白質質量濃度/(mg/mL)2.33±0.01 2.38±0.02 2.53±0.01 2.24±0.01

硫酸銨鹽析是一種較常見且有效的蛋白粗提方式。當鹽濃度高到一定程度的時候，過多的鹽會跟蛋白質疏水表面爭奪水分子，以至于蛋白質疏水表面傾向于相互作用形成聚合物沉淀。由表1可知，Pep X在0%～40%、40%～60%硫酸銨飽和度條件下，蛋白酶活力最高，酶比活力也最高，因此選擇0%～60%為合適的硫酸銨鹽析飽和度。

2.1.2 Sephacryl S-300 HR凝膠層析

圖1 Pep X的Sephacryl S-300 HR層析圖Fig.1 Sephacryl S-300 chromatography of Pep X

表2 Sephacryl S-300 HR 各峰的Pep X活性(±s)Table 2 Pep X activity of Sephacryl-S-300 HR (±s)

表2 Sephacryl S-300 HR 各峰的Pep X活性(±s)Table 2 Pep X activity of Sephacryl-S-300 HR (±s)

組分 1 2 3 4 Pep X酶活力/(U/mL) 5.22±0.07 6.55±0.14 10.23±0.20 6.15±0.22 Pep X酶比活力/(U/mg) 4.71±0.06 4.10±0.09 11.56±0.23 32.72±1.18蛋白質質量濃度/(mg/mL)1.11±0.02 1.60±0.05 0.88±0.04 0.19±0.02

由圖1可知，0%～60%硫酸銨鹽析粗提物共分離出4個組分的酶活力。由表2可知，第3個組分Pep X酶活相對較高，酶比活力也較高，第4組分酶比活力雖然很高，但是提取得到的Pep X量太少，所以選擇蛋白含量較高、酶活也相對較高的第3組分進行下一步分離純化。

2.1.3 Pep X的分離純化

圖2 PepX的非變性PAGE和SDS-PAGE電泳圖Fig.2 Native-PAGE and SDS-PAGE of Pep X

圖2 b為Sephacryl S-300 HR凝膠層析分離后第3組分的非變性PAGE電泳圖譜，可見有4條蛋白帶。圖2a為電泳時在分離膠中加入Pep X的底物的非變性PAGE電泳圖譜，可發現有1條蛋白帶消失。根據1.3.6.2節方法切膠回收Pep X，測定酶比活力為62.24U/mg。然后用SDSPAGE檢測分子質量及純度，由圖2c可知，經切膠純化后的Pep X為單條帶，單體分子質量推測約為26kD。

表3 Pep X純化過程及結果Table 3 Summary of the purification procedures of Pep X

通過硫酸銨鹽析、Sephacryl S-300 HR層析、非變性-PAGE切膠回收蛋白純化了瑞士乳桿菌Pep X，最后得到了電泳純Pep X。由表3可知，其回收率為4.74%，提純倍數為29.39。

2.2 Pep X的酶學性質

2.2.1 最適酶反應pH值

圖3 pH值和溫度對Pep X活性的影響。Fig.3 Effects of pH and temperature on Pep X activity

由圖3a可知，Pep X的最適反應pH值為6.0～7.0，當pH值為7.0時，酶活性最高，將其作為相對酶活力100%，pH值為9.0時，相對酶活力下降至15%。

2.2.2 最適酶反應溫度

由圖3b可知，當溫度在37～41℃時，Pep X的酶活力較高，其中37℃時為最高。

2.2.3 pH值對酶穩定性的影響

由圖3c可知，以不同pH值的緩沖液處理Pep X，保溫1h，Pep X的酶活力受到一定影響，當pH值為9.0時，Pep X酶活力下降至10%，當pH值為5.0時，殘留酶活力為63%，這說明Pep X在酸性條件下比較穩定。

2.2.4 溫度對酶穩定性的影響

由圖3d可知，溫度對Pep X酶活力的穩定性有一定影響。當Pep X在55℃保溫30min時，殘留酶活力顯著下降至40%，當酶在85℃保溫30min時，殘留酶活力下降至20%，這說明Pep X耐熱性較差。

2.2.5 抑制劑和金屬離子對酶活力的影響

由表4可知，Co2+對Pep X的活性有激活作用，Zn2+、Ni2+、Mn2+、Fe3+對Pep X活性有強烈的抑制作用，K+、Na+對蛋白酶活性影響不大，其他金屬離子都有一定的抑制作用。絲氨酸蛋白酶抑制劑PMSF對Pep X抑制作用較大，在PMSF濃度為10mmol/L時，相對酶活力為15.103%，金屬蛋白酶抑制劑EDTA對Pep X酶活力也有一定的抑制，說明Pep X為金屬依賴性的絲氨酸蛋白酶。

3 討 論

關于Pep X的提取已有相關報道。如Vesanto等[16]研究發現Lactobacillus helveticus的Pep X最適酶反應pH值為6.5，最適酶反應溫度為45℃；Pep X是一個二聚體，分子質量為165kD，Cu2+、Cd2+和Zn2+抑制Pep X活性，EDTA也能夠抑制Pep X的活性，PMSF強烈抑制Pep X的活性，說明Pep X是一個金屬依賴性的絲氨酸肽酶。本實驗純化Pep X經過SDS-PAGE后發現單體蛋白分子質量約在26kD左右，與Vesanto等[16]報道的有一些差異，所以考慮Pep X也可能以多聚體形式存在，具體還將進一步研究。Lactobacillus delbrueckiissp.bulgaricusLBU-147的Pep X為三聚體，單體的分子質量經SDS-PAGE測定為90kD，最適的pH值為6.5，最適溫度為50℃，Hg2+、Cu2+、Fe3+強烈抑制其活性[17]。Lactobacillus sanfranciscensisCB1的Pep X為單聚體，SDS-PAGE測定分子質量為49.2～56kD，最適酶反應pH值為6.0，最適酶反應溫度為30℃，Zn2+、Hg2+和Mn2+抑制酶的活性[18]。來源于Streptococcus thermophilusACA-DC4的Pep X分子質量為80kD，最適酶反應pH值為7.0，最適酶反應溫度為50℃，PMSF強烈抑制其活性[19]。Degraeve等[20]對Lactobacillus helveticusITG LH1的Pep X進行了純化，采用離子交換層析和親和層析的方法純化了Pep X，Pep X為單體結構，分子質量為140kD，最適酶反應pH值為7.0，酶反應溫度為40℃，但在50℃以上活性降低。0.1mmol/L HgCl2、1mmol/L SnCl2和2.5mmol/L CuCl2完全抑制其活性，同時還可以被PMSF抑制活性。從Pep X的研究報道可以看出，不同乳酸菌的Pep X在分子質量、最適酶反應pH值和最適酶反應溫度都有一定的差別。但Pep X的活性都受金屬離子的影響，并且能被PMSF抑制其活性，說明乳酸菌的Pep X是金屬依賴性的絲氨酸肽酶。

本實驗通過硫酸銨沉淀、Sephacryl S-300 HR層析、非變性-PAGE切膠回收蛋白純化了瑞士乳桿菌的Pep X，得到了電泳純Pep X，酶比活力為62.24U/mg。瑞士乳桿菌Pep X經SDS-PAGE測定單體分子質量大約為26kD，最適酶反應pH值為7.0，最適酶反應溫度為37℃，在酸性條件下較穩定，耐熱性較差。Co2+對Pep X有激活作用，Zn2+、Ni2+、Mn2+、Fe3+對Pep X有強烈的抑制作用，金屬蛋白酶抑制劑EDTA、絲氨酸蛋白酶抑制劑PMSF對Pep X有一定的抑制作用，說明Pep X金屬依賴性的絲氨酸肽酶。后期將擬利用純化的Pep X水解乳蛋白，對水解后產物進行ACE抑制活性測定，分離純化水解產物并測定氨基酸序列，如能確定Pep X可特異性水解乳蛋白產生ACE抑制肽，可作為工具酶為今后ACE抑制肽的規模化制備提供一定的應用基礎。

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