韭菜酸性磷酸酶的分離純化及酶學性質

孫 芳，任美鳳，胡瑞斌，唐云明*

(西南大學生命科學學院，重慶市甘薯工程研究中心，三峽庫區生態環境教育部重點實驗室，重慶 400715)

酸性磷酸酶(acid phosphatase，ACP，EC3.1.3.2)是一類在酸性條件下水解磷酸單酯鍵釋放出無機磷的巰基酶[1]，是生物體內參與磷代謝的重要酶類[2]。它還在物質代謝調節、能量轉換以及信號傳導等途經中發揮重要的作用[3]。該酶具有廣泛的應用價值，是酶標免疫測定技術的常用工具酶之一[4]。也可作為食品、飲料的添加劑[5]。此外，它在農產品農藥殘留檢測中具有重要的作用[4]，它還可以作為檢測指示性酶類，用于檢定牛乳及蛋品中微生物的水平[6]，為食品安全提供有力的保障。因此獲得來源廣低成本的ACP具有重要的理論和實踐意義。韭菜屬于百合科多年生宿根草本植物，是常年的綠葉蔬菜之一[7]，具有豐富的營養價值及藥用功能。本實驗以韭菜為研究材料，分離純化了其中的1種ACP，并對其部分酶學性質進行研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

韭菜采自西南大學實驗基地。

對硝基苯磷酸二鈉(pNPP) 美國Amresco公司；CM-Sepharose、Superdex-200、凝膠過濾層析分子質量標準品、蛋白質SDS-PAGE標準品 美國GE Healthcare 公司；牛血清白蛋白 美國Sigma公司；丙烯酰胺、甲叉-雙丙烯酰胺 瑞士Fluka公司；其余試劑均為國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 韭菜ACP粗酶液的制備

稱取清洗干凈并擦干的新鮮韭菜120g，剪碎，按1:2(m/V)的比例加入預冷的50mmol/L HAc-NaAc緩沖液(pH5.0，含3mmol/L MgCl2、10mmol/L巰基乙醇(ME)、2mmol/L EDTA-Na2)；用組織搗碎機打碎，4℃冰箱抽提2.5h，紗布過濾后濾液在4℃條件下12000r/min離心20min，收集上清液；向其中加入硫酸銨至40%飽和度，4℃靜置2.5h后，4℃條件下12000r/min離心30min，收集上清液；再向其中加入硫酸銨至65%飽和度，4℃、鹽析3h后，4℃條件下12000r/min離心35min，收集沉淀；沉淀用50mmol/L HAc-NaAc緩沖液(pH5.0)溶解，測定ACP的酶活力和蛋白質含量后透析，除去SO42-后得粗酶源。

1.2.2 CM-Sepharose離子交換層析

CM-Sepharose離子交換層析柱經50mmol/L HAc-NaAc(pH5.0)緩沖液平衡后，取粗酶液10mL上柱，用0～1mol/L的NaCl溶液(由50mmol/L、pH5.0 HAc-NaAc緩沖液配制而成)進行線性梯度洗脫，流速為0.5mL/min，每管收集5mL；分別測定各管酶活力以及蛋白質含量，收集ACP活性較高的酶液，在4℃條件下用5mmol/L HAc-NaAc緩沖液(pH5.0)透析脫鹽，冷凍干燥濃縮后進行凝膠過濾層析。

1.2.3 Superdex-200凝膠過濾層析

取經1.2.2節方法處理后得到的酶液5mL上Superdex-200層析柱，用50mmol/L HAc-NaAc (pH5.0)緩沖液進行洗脫，流速0.3mL/min，每管收集3mL；分別測定各管ACP活性和蛋白質含量；收集活性較高的酶液用超純水透析，冷凍干燥后，得到粉末狀的酶制品，置于－20℃冰箱保存備用。

1.2.4 韭菜ACP純度鑒定及分子質量測定

采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳對1.2.3節獲得的ACP進行純度鑒定。制備12%分離膠、5%濃縮膠，上樣量為12μL。經凝膠過濾層析和SDS-PAGE測定其分子質量[8]。

1.2.5 蛋白質濃度的測定

采用紫外分光光度法以及考馬斯亮藍染料法(Bradford法)對本實驗中的蛋白質含量進行測定[8]。

1.2.6 ACP活力的測定

參照文獻[9]略微改進為：3mL 0.2mol/L HAc-NaAc pH5.0緩沖液(含5mmol/L ME)、1mL 10mmol/L MgSO4及1mL 5mmol/L pNPP，于37℃水浴5min后，加入100μL酶液，反應10min，加入2.5mL終止劑(0.2mol/L NaOH)終止反應。以雙蒸水代替酶液作為對照，在420nm波長處測定光吸光度。根據對硝基苯酚(PNP)標準曲線[10]計算產物生成量。在此反應條件下，每10min催化底物水解生成1μmol對硝基苯酚所需的酶量為一個酶活力單位。

1.2.7 韭菜ACP性質的測定

1.2.7.1 韭菜ACP的最適反應溫度與熱穩定性

在不同溫度(20～60℃，梯度為10℃；60～80℃，梯度為5℃)條件下測定ACP的酶活力，以酶活力最高值為100%，計算其他條件下的相對酶活力，以研究其最適反應溫度。將酶液放置在不同的溫度(25～75℃，梯度為10℃)條件下，每間隔一定時間測定ACP的酶活力，以酶液不保溫時的酶活力為100%，計算溫育不同時間下酶的相對活力，以研究該酶的熱穩定性。

1.2.7.2 韭菜ACP的最適pH值與pH值穩定性

在不同pH值(4.2～6.0)條件下測定ACP的酶活力，以酶活力最高值為100%，計算其他pH值條件下的相對酶活力，以研究該酶的最適反應pH值。將純化后的酶液分別置于不同pH值(3～9)的緩沖溶液中，放置不同的時間，然后測定ACP的酶活力，以酶液最適pH值條件下酶活力作為100%，計算不同pH值條件下酶的相對活力，以研究該酶的pH值穩定性。

1.2.7.3 韭菜ACP米氏常數(Km)的測定

在pH 5.0、37℃條件下，以不同濃度的pNPP(0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mmol/L)為底物，測定韭菜ACP的酶活力，采用雙倒數作圖法(Lineweaver-Burk法)作圖求出該酶的Km值。

1.2.7.4 不同化合物對韭菜ACP活性的影響

向含有不同濃度化學試劑EDTA-Na2、尿素、H2O2、抗壞血酸的4mL pH5.0，0.2mol/L HAc-NaAc緩沖液中，分別加入200μL酶液，于4℃作用30min后，置于37℃水浴5min，然后加入1mL底物，反應10min后終止，測定酶活力。以不加化合物時的酶活力為100%，計算不同條件下的相對酶活力。

1.2.7.5 不同有機溶劑對韭菜ACP活性的影響

向含有不同體積分數有機溶劑甲醇、乙醇、異丙醇、正丁醇、氯仿的4mL pH5.0、0.2mol/L HAc-NaAc緩沖液中，分別加入200μL酶液，其余方法同1.2.7.4節。以不加有機溶劑時的酶活力為100%，計算不同條件下的相對酶活力。

1.2.7.6 不同金屬離子對韭菜ACP活性的影響

分別配制各種金屬離子母液，濃度為10mmol/L，再按一定的量和200μL酶液混合(混合后各金屬離子終濃度分別為1、2、3、4、5mmol/L)，在4℃條件下放置30min后，加入4mL pH5.0，0.2mol/L HAc-NaAc緩沖液，置于37℃水浴5min，然后加入1mL底物，反應10min后終止，測定酶活力。以不加金屬離子時的酶活力為100%，計算各金屬離子濃度下酶的相對活力。

2 結果與分析

2.1 韭菜ACP的分離純化

韭菜ACP粗酶液經CM-Sepharose層析后的結果如圖1所示，可見有兩個活力峰(31～35管以及36～40管)，由于酸性磷酸酶通常存在多種同工酶，因此可以判斷韭菜中的酸性磷酸酶存在兩種同工酶形式。收集多次36～40管中的酶液，透析冷凍干燥濃縮后，經Superdex-200層析，洗脫圖譜如圖2所示，酶活性峰主要集中在33～37管之間，其中34管酶活最高。收集活性峰，透析冷凍干燥后，樣品經SDS-PAGE顯示為單一條帶(圖3)，說明該酶已達電泳純，酶的整個分離純化結果如表1所示。最終得到的韭菜ACP純品的純化倍數為454.81倍，回收率為10.50%，酶比活力達到645.83U/mg。

圖1 韭菜ACP的CM-Sepharose離子交換層析圖譜Fig.1 CM-Sepharose ion-exchange chromatogram of ACP from Chinese chives

圖2 韭菜ACP的Superdex-200凝膠過濾層析圖譜Fig.2 Superdex-200 gel filtration chromatogram of ACP from Chinese chives

表1 韭菜ACP純化的結果Table 1 Purification of ACP from Chinese chives

圖3 韭菜ACP的SDS-PAGE電泳圖譜Fig.3 SDS-PAGE of purified ACP from Chinese chives

2.2 韭菜ACP分子質量的測定

經Superdex-200凝膠過濾層析測得全酶分子質量約為59.58kD，經SDS-PAGE測得酶的亞基相對分子質量約為58.97kD，由此基本可以斷定韭菜ACP是單亞基酶。

2.3 韭菜ACP的部分酶學特性

2.3.1 韭菜ACP的最適反應溫度與熱穩定性

圖4 溫度對韭菜ACP活力的影響Fig.4 Effect of temperature on the activity of ACP from Chinese chives

圖5 韭菜ACP的熱穩定性Fig.5 Thermal stability of ACP from Chinese chives

由圖4可知，該酶的最適反應溫度為65℃。酶的熱穩定性實驗結果如圖5所示，在25～35℃溫度范圍內，該酶比較穩定；在45～75℃溫度范圍內，隨著溫度升高，酶活性明顯降低，其中65℃保溫1.5h以及75℃保溫0.5h后，酶活力幾乎完全喪失。

2.3.2 韭菜ACP的最適pH值和pH值穩定性

圖6 pH值對韭菜ACP活性的影響Fig.6 Effect of pH on the activity of ACP from Chinese chives

由圖6可知，韭菜ACP的最適pH值為5.4，這與ACP的最適pH值一般小于6的特點相符。由圖7可知，韭菜ACP的pH值耐受范圍較廣，在pH5～8的條件下，穩定性較好，酶活性變化趨勢比較緩慢，放置10h后，相對酶活力還高達60%以上；當pH值小于4或者大于等于9時，酶蛋白分子結構發生變化，酶活性下降很快。

圖7 韭菜ACP的pH值穩定性Fig.7 pH Stability of ACP from Chinese chives

2.3.3 韭菜ACP的米氏常數

圖8 雙倒數法測韭菜ACP的米氏常數Fig.8 Determination of Km of ACP from Chinese chives by Lineweaver-Burk plot

由圖8可知，韭菜ACP對pNPP的Km值為0.896×10-3mol/L。

2.3.4 不同化合物對韭菜ACP活性的影響

圖9 不同化合物對韭菜ACP活力的影響Fig.9 Effect of various compounds on the activity of ACP from Chinese chives

由圖9可知，隨著化合物濃度的增大，所加的幾種化合物對韭菜ACP的活性都表現出了抑制作用，其中，抗壞血酸對該酶的抑制作用非常明顯，尿素和EDTA-Na2對該酶影響不強烈。過氧化氫對酶活的影響是先下降，當濃度為20～30mmol/L時，酶活又回升，當濃度高于30mmol/L時，酶活又逐漸下降，即低濃度與過高濃度時，酶活性都會受到抑制。

2.3.5 不同有機溶劑對韭菜ACP活性的影響

由圖10可知，在甲醇、乙醇、異丙醇、氯仿4種有機溶劑作用下，該酶活性均受到了很強的抑制。隨著有機溶劑體積分數的增大，這種抑制作用就更強，當體積分數達到60%時，幾乎抑制了該酶70%的酶活。而正丁醇對酶活性幾乎沒有影響。

圖10 不同有機溶劑對韭菜ACP活力的影響Fig.10 Effect of various organic solvents on the activity of ACP from Chinese chives

2.3.6 不同金屬離子對韭菜ACP活性的影響

圖11 不同金屬離子對韭菜ACP活力的影響Fig.11 Effect of various metal ions on the activity of ACP from Chinese chives

由圖11可知，不同金屬離子以及同一金屬離子的不同濃度對韭菜ACP活性的影響存在著很大的差異。隨著離子濃度的增大，Mn2+和Mg2+對酶活性有明顯的激活作用，說明這兩種離子有可能促進了韭菜ACP空間構象的改變，從而提高了酶的催化效率；Ca2+、Pb2+、Zn2+、Cu2+、Ag+對該酶有較強的抑制作用，其中Cu2+、Ag+對該酶的抑制作用更強，當Ag+濃度達到4mmol/L時，酶活性完全喪失。而Ba2+對酶活性沒有影響。

3 討 論

本實驗以韭菜為提取材料，通過一系列純化步驟獲得了電泳純的酸性磷酸酶。與從其他材料中分離純化得到ACP的實驗相比有如下優點：首先，材料來源廣，一年四季均可取材，價格低廉；其次，純化步驟更為簡便化、提純倍數高、酶比活力高。本實驗所得的ACP回收率較低，一方面是因為ACP同工酶較多[9]，經過一系列純化步驟去除了部分同工酶，只收集了其中一種活力較高的ACP；另一方面是因為離子交換層析后透析冷凍干燥濃縮，損失了一部分酶活性的緣故。

該酶最適反應溫度為65℃，高于一般來源的ACP，在該溫度下，酶的構象發生了改變，使酶活性中心更適合與底物結合，從而酶活性得到升高[11]，但在此溫度下酶的穩定性不高，隨著保溫時間的延長，酶活力迅速下降，說明這種構象是不穩定的。該酶pH值耐受范圍較廣，在pH5～8的環境中穩定性較好，最適pH5.4，與麥芽(pH5.4)[12]、菜豆(pH5.6)[13]、洋蔥(pH5.7)[14]來源的ACP近似，但與刺參(pH4.4)[11]以及背角無齒蚌(pH4.8)[15]來源的ACP不同，表明不同材料來源的ACP對pH的適應性存在著較大的差異。

該酶的分子質量約為58.97kD，這與斑玉蕈[16]來源的ACP(65kD)相近，但與海參[17]來源的ACP(147.9kD)以及蚯蚓[18]來源的ACP(113kD)不同，反映出ACP作為一種誘導酶，其分子結構的物種特異性[9]。該酶Km值為0.896×10-3mol/L，與草魚[19]來源的ACP(Km值為0.232×10-3mol/L)相比差異較大，與背角無齒蚌[15]來源的ACP(Km值為0.73×10-3mol/L)相近,表明不同材料中ACP對底物的親和能力不同。

Ca2+、Pb2+、Zn2+、Cu2+、Ag+對韭菜ACP有較強的抑制作用，這可能是因為金屬離子直接作用于該酶的活性部位，從而使酶活性受到了部分抑制[9]；其中4mmol/L的Ag+即可使該酶活性完全喪失，這與斑玉蕈[16]和刺參[11]中Pb2+及Ag+對ACP的抑制作用強烈的特性相似；而在黑綠豆[20]中Cu2+對酶有激活作用，在草魚[19]中Ca2+對酶有激活作用，在淡水魚肌肉[21]和背角無齒蚌[15]中，Zn2+對酶都有激活作用；Mn2+和Mg2+對韭菜ACP酶活性有明顯的激活作用，這與草魚[19]以及仿刺參[22]中ACP研究結果相符，但與洋蔥[14]以及黑綠豆[20]中Mg2+對ACP活性有強烈的抑制作用的研究結果相反；以上對比說明ACP的來源不同，同種金屬離子對不同來源的酶活性會表現出不同的效應。

不同來源的ACP在酶學性質上存在著較大的差異，主要是因為在不同物種的不同組織中，生物體為了適應環境，滿足不同生長代謝的需求，會產生以多種同工酶的形式存在的ACP，這是生物體不斷進化、基因不斷變化并選擇性表達的結果[16]。

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