短乳桿菌發酵生產尿苷磷酸化酶條件的優化

王偉潔，李紅梅,*，鄧龍華，高露姣，黃艷青

(1.上海理工大學醫療器械與食品學院，上海 200093；2.中國水產科學研究院東海水產研究所，上海 200090)

尿苷磷酸化酶是嘧啶補救途徑中的關鍵酶，具有可逆性催化尿苷轉變為尿嘧啶的異化和磷酸化作用，廣泛存在于生物有機體中。尿苷磷酸化酶在酶法合成抗腫瘤核苷類藥物中具有重要作用[1]，其中脫氧氟尿苷DFUR是一種良好的抗代謝類抗腫瘤藥物，在腫瘤細胞內受腫瘤組織中嘧啶磷酸化酶的作用而轉化為真正起作用的5-氟尿嘧啶；此外尿苷磷酸化酶在腫瘤診斷中具有一定醫學價值，腫瘤組織細胞中尿苷磷酸化酶的含量比正常細胞高很多，可以作為細胞癌變的檢測指標[2]。

目前通過傳統篩選和誘變技術獲得了一些具有較高酶活力的菌種如產氣腸桿菌、乙酰短桿菌等應用于核苷類似物的酶法合成[3]，但關于短乳桿菌產核苷磷酸化酶卻鮮有報道，野生型短乳桿菌仍存在產酶量相對較低等缺點，因此如何提高短乳桿菌產核苷磷酸化酶具有重要的研究和應用價值。

現有篩選重要影響因子的方法中，以Plackett-Burman設計最具優勢，它能快速有效地從眾多因子中篩選出影響短乳桿菌產尿苷磷酸化酶顯著的因子[4-5]。響應面法能快速對影響顯著因子進行優化與評價，并確定各因素最佳組合和響應值的最優值[6]。目前響應面分析方法已大量應用于微生物工程領域的實驗分析中[7-9]。因此，以短乳桿菌為出發菌，以葡萄糖酵母膏培養基為基礎培養基，利用Plackett-Burman設計、最陡爬坡試驗及響應面法對影響酶活的各因子水平及其交互作用進行優化與評價，并快速有效地確定多因子系統的最佳條件，旨在為高產尿苷磷酸化酶菌株的開發、應用以及產酶發酵條件優化等相關研究及后續研究提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 菌株

短乳桿菌 本實驗室保存。

1.2 試劑

胸苷、肌苷、尿苷、尿嘧啶等 河南新鄉拓新生化股份有限公司；其他化學試劑(均為分析純) 國藥集團藥業公司。

1.3 培養基及培養條件

1.3.1 培養基

菌種活化液(g/L)：酵母粉10.0，pH7.0～7.2；斜面培養基(g/L)：葡萄糖20.0、酵母粉10.0、氯化鈉5.0、瓊脂20.0，pH7.0～7.2；初始發酵培養基(g/L)：葡萄糖20.0、酵母粉10.0、氯化鈉5.0，pH7.0～7.2；發酵培養基：根據不同實驗設計要求，改變培養基的各組分。

1.3.2 培養條件

將保存于深冷冰箱的短乳桿菌接種在固體斜面培養基上36℃培養24h，4℃冰箱中保存備用。無菌環境下從斜面培養基上挑取單一菌落菌體接種到裝液量為50mL的250mL錐形瓶活化液中，在36℃搖床轉速為110r/min條件下活化10～12h，然后接種到發酵培養基中，同樣條件下繼續培養12h收集菌體。

1.4 酶活力測定

1.4.1 濕菌體的收集

將培養好的菌液4500r/min常溫離心15min，去除上清液后，用無菌水和pH7.3無菌磷酸鉀緩沖液各沖洗1次，離心去上清，收集濕菌體冷藏備用。

1.4.2 尿苷磷酸化酶活測定方法

據Saunders等[10]報道，采用紫外分光光度法測定反應生成的尿嘧啶來表征產酶量。標準酶反應混合液包含一定濃度的濕菌體50mg/mL反應液，25mmol/L尿苷，1mmol/L EDTA，pH7.3、50mmol/L的磷酸鉀緩沖溶液。55℃條件下反應120min，反應結束后，反應液在沸水中煮沸5min終止反應，離心去除沉淀[11]。上清液用pH12的NaOH稀釋100倍，以未添加菌體的反應液作為對照測定不同培養基及培養條件下反應液在290nm波長處的紫外光密度OD290nm的增值[12]。尿苷磷酸化酶酶活單位定義為：在上述條件下，1min內OD290nm變化0.01所需的濕菌體量定義為短乳桿菌的1個酶活力單位[3]。

式中：K為稀釋倍數，取100；t為酶反應時間(120min)；m為濕菌體質量(50mg)。

1.5 發酵培養基的優化

1.5.1 單因素試驗

在基礎發酵培養基中，分別添加適量的速效氮源蛋白胨、金屬離子Mg2+(MgCl2·6H2O)、磷酸根(K2HPO4·3H2O)、底物誘導劑(胸苷、肌苷及尿苷)，考察其對短乳桿菌產尿苷磷酸化酶的作用。

1.5.2 Plackett-Burman試驗設計

根據文獻查閱及前期單因素試驗研究[13-14]，選取發酵溫度、發酵時間、搖床轉速、接種量、葡萄糖、酵母粉、蛋白胨、磷酸根、尿苷和肌苷作為Plackett-Burman設計的10個因素，以尿苷磷酸化酶活作為響應值，每個因素取兩個水平，高水平(＋1)約是低水平(－1)的1.5～2倍，另設3個虛擬列：X3、X6、X10以考察試驗誤差。通過比較各因素的顯著水平，篩選出對酶活力影響較為顯著的因素。試驗設計見表1。

表1 Plackett-Burman試驗設計方案Table 1 Factors and levels used in Plackett-Burman design

1.5.3 最陡爬坡試驗

根據Plackett-Burman試驗結果分析確定顯著影響因素，以擬合的回歸方程模型的系數符號和大小來設定顯著因素的步長和變化方向，即對顯著因素進行濃度梯度設計，使響應值快速逼近最大響應區間。

1.5.4 Box-Behnken設計

根據Box-Behnken中心組合試驗設計原理[15-16]，以葡萄糖、磷酸根、尿苷、酵母粉4個因素為自變量，以尿苷磷酸化酶活為響應值，設計四因素三水平的響應面分析試驗，并用Design-Export 8.0軟件對試驗數據進行回歸分析。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗篩選

利用底物誘導(胸苷、肌苷和底物尿苷)、添加金屬離子(MgCl2·6H2O)、速效氮源(蛋白胨)和磷酸鹽(K2HPO4·3H2O)等手段提高短乳桿菌產尿苷磷酸化酶能力[13]，結果如表2所示。可以看出，蛋白胨、磷酸根、肌苷和尿苷4個因素對短乳桿菌合成尿苷磷酸化酶有一定的促進作用。蛋白胨為菌體生長提供充足的氮源，提高菌體單位時間內的豐度；磷酸根是尿苷磷酸化酶催化尿苷可逆磷酸化反應的有效因子，可能會促進菌體產尿苷磷酸化酶；而核苷、核苷酸及堿基對核苷磷酸化酶有一定的誘導作用，但不同微生物對誘導劑的響應不同，E.coli中尿苷磷酸化酶可由胞苷誘導表達[14]，Salmonella typhimurium中尿苷磷酸化酶由尿苷和胞苷誘導[17]，本研究發現，尿苷和肌苷可誘導短乳桿菌產尿苷磷酸化酶。

表2 單因素試驗設計方案及結果Table 2 Single factor design and corresponding results

2.2 Plackett-Burman設計及優化

選用Factors=10，Runs=20的Plackett-Burman設計，見表3。根據表3結果采用Minitab15.0軟件進行方差分析，結果(表4)表明，在發酵過程中，肌苷、發酵時間、酵母粉、磷酸根、蛋白胨及底物尿苷6個因素對短乳桿菌合成尿苷磷酸化酶呈正效應關系，而搖床轉速、接種量、發酵溫度及葡萄糖添加量4個因素對短乳桿菌合成尿苷磷酸化酶呈負效應關系。

表3 Plackett-Burman試驗設計及結果Table 3 Plackett-Burman design arrangement and corresponding results

表4 Plackett-Burman試驗結果的方差分析Table 4 Analysis of variance for the Plackett-Burman experimental design

在Plackett-Burman設計中，一般認為P＜0.1的因素對系統的響應值影響較為顯著，本研究中葡萄糖(P=0.002)、酵母粉(P=0.054)、磷酸根(P=0.059)和尿苷(P=0.001)對短乳桿菌合成尿苷磷酸化酶的影響較為顯著，因此將這4個因素作為主要因素進行最陡爬坡試驗和響應面試驗。其他因素正效應取高水平，負效應取低水平。其中葡萄糖和尿苷濃度對短乳桿菌產尿苷磷酸化酶影響非常顯著(P＜0.01)，葡萄糖添加量過低，導致營養不足，添加量過高，可能會出現葡萄糖限制或其產物的抑制，均不利于尿苷磷酸化酶的產生[13]；尿苷可以促進尿苷磷酸化酶活的試驗結果可以初步判斷尿苷磷酸化酶為誘導酶，添加酶底物尿苷可以顯著提高短乳桿菌產酶量，這與Salmonella typhimurium[17]、Klebsiellasp.[18]產尿苷磷酸化酶可被尿苷誘導表達研究一致。

2.3 最陡爬坡試驗結果

Plackett-Burman試驗結果顯示葡萄糖為負效應，在后續設計中添加量應減小；酵母粉、磷酸根添加量和尿苷濃度3個因素均為正效應，在后續的設計中添加量應增加。因此最陡爬坡試驗設計應根據各個因素效應大小比例，來設定它們的變化步長，如表5所示，短乳桿菌產尿苷磷酸化酶能力在第3組達到最大值(1.198U/mg)，因此，以第3組作為響應面試驗的中心點。

表5 最陡爬坡試驗設計及結果Table 5 Steepest ascent design and corresponding results

2.4 Box-Behnken響應面試驗結果及方差分析

Box-Behnken試驗設計與結果見表6，對試驗結果用Design Export 8.0響應面分析軟件進行多元回歸分析，結果見表7。經擬合得到二次回歸數學模型，獲得短乳桿菌產尿苷磷酸化酶能力對葡萄糖、磷酸根、尿苷及酵母粉添加量的二次多項回歸方程為：

由該方程的方差分析可見，該模型極顯著(P＜0.0001)，失擬度在α=0.05水平上不顯著(P=0.0584＞0.05)，而且經分析計算，該模型的確定系數R2=0.9183，表明模型與實際情況擬合很好，因此該模型可用于預測短乳桿菌產尿苷磷酸化酶能力的實際情況[19]。由回歸方程得到優化結果為葡萄糖18.30g/L、磷酸根3.99g/L、尿苷21.38mmol/L、酵母粉15.71g/L，預測響應面最大值為1.30887U/mg。

利用Design Export 8.0軟件繪出方程的響應面圖及等高線分析圖，響應面分別代表兩個獨立變量之間對響應值尿苷磷酸化酶活力的影響，并可以直接地反映出最優值；等高線的形狀可以反映兩因素間交互作用的強弱大小，圓形表示交互作用不顯著，橢圓形表示交互作用顯著。由圖1可知，磷酸根-酵母粉的交互作用等高線呈橢圓形，表明磷酸根-酵母粉交互作用對尿苷磷酸化酶活影響顯著，其他因素間交互作用影響不顯著。

表6 Box-Behnken試驗設計與結果Table 6 Box-Behnken design arrangement and corresponding results

表7 響應面回歸模型的方差分析Table 7 Analysis of variance for the response surface regression model

圖1 磷酸根與酵母粉添加量相互作用對尿苷磷酸化酶產量的響應面立體分析圖與等高線圖Fig.1 Response surface and contour plots showing the interaction effects of various factors on the yield of uridine phosphorylase

2.5 模型方程的驗證

響應面法分析得到的最優結果并沒有在設計的試驗組合中，為了進一步驗證模型的可靠性，在最佳培養條件下，做5次重復實驗，得到尿苷磷酸化酶活為1.325U/mg，基本與響應面預測的最大值1.30887U/mg符合，說明響應面法優化得到的數學模型與實驗數據擬合較好。在基礎發酵培養基發酵條件下，短乳桿菌產尿苷磷酸化酶能力為0.883U/mg，優化后提高了50.0%。

3 結 論

提高菌體產酶量最有效的方法主要是通過改良微生物產酶培養基。短乳桿菌產尿苷磷酸化酶過程中，影響產酶量的因素很多，且因素之間相互聯系。本實驗通過單因素試驗確定了蛋白胨、磷酸根、尿苷及肌苷4個因素為促進短乳桿菌產尿苷磷酸化酶的有效因子，并通過Plackett-Burman試驗篩選出影響尿苷磷酸化酶活的顯著因子，進而利用最陡爬坡試驗逼近最大響應區域，最后通過響應面法優化短乳桿菌產尿苷磷酸化酶發酵培養基配方為：NaCl 5g/L、葡萄糖18.30g/L、酵母粉15.71g/L、蛋白胨15g/L、磷酸根3.99g/L、肌苷20mmol/L、尿苷21.38mmol/L；發酵條件：pH8.0、搖床轉速110r/min、發酵溫度32℃、培養時間14h、接種量1.0%。在優化培養基的基礎上進行驗證實驗，尿苷磷酸化酶活力達1.325U/mg，較優化前的酶活力0.883U/mg提高了50.0%。以上結果表明通過響應面法優化短乳桿菌產尿苷磷酸化酶發酵培養基及其發酵條件是可行有效的，這為進一步通過選育菌種、代謝調控等技術提高酶活提供了研究基礎。

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