低聚乳果糖對結腸炎大鼠血漿Th1/Th2型細胞因子的影響

周 艷，阮 征,*，黃小流，李 玲，劉文群，溫艷梅，米書梅，吳 信,3，印遇龍,3

(1.南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047；2.南昌大學生命科學與食品工程學院，江西 南昌 330031；3.中國科學院亞熱帶農業生態研究所，湖南 長沙 410125)

隨著社會經濟的發展和人們生活方式的改變，居民的膳食結構發生了巨大變化，肥胖、糖尿病、高血脂、高血壓等系列代謝紊亂的發生率越來越高。近年，越來越多的研究顯示腸道在代謝綜合癥的發展過程中起著重要的作用[1-2]，其中腸道炎癥的發生要早于肥胖和胰島素耐受[3]，被認為是引起肥胖和胰島素耐受的起始因素[4]。炎癥性腸病(inf lammation bowel disease，IBD)是一種病因不明、反復發作的腸道慢性炎癥，主要包括潰瘍性結腸炎((ulcerative colitis，UC)和克羅恩病(Crohn’s disease，CD)，在西方國家較為常見，其發病率達千分之一二[5]，同時在我國越來越多的人遭受IBD的困擾[6]。該病主要表現為腹痛、腹瀉以及便血，可發生于任何年齡階段，病程時間長，甚至有發生癌變的可能性，其治療缺乏特異性方法[7]。

藥物控制仍是緩解/治療結腸炎的主要途徑，然而由于藥效的局限性，及該病反復發作性，使很多患者面臨著終身服藥的困境。柳氮磺胺吡啶(SASP)是目前治療結腸炎的首選藥物之一，它在腸道菌群偶氮還原酶的作用下分解成5-氨基水楊酸(5-ASA)和磺胺吡啶(SP)，5-ASA是主要的活性成分，而SP是產生副作用的主要物質[8]。研究顯示SASP的副作用與劑量呈正相關，能引起約30%患者不能耐受[9]，當服用劑量較大時，可能引起慢性肝、腎功能衰竭[10]。因此，尋找安全有效途徑緩解腸道慢性炎癥，不僅能提高IBD患者的健康狀況，而且可預防慢性綜合征的發生，提高生活質量。

圖1 低聚乳果糖的結構Fig.1 Structure of lactosucrose

通過天然活性物質調控腸道炎癥水平是一種的重要途徑。益生元以其良好的腸道微生態和免疫調節作用日益受到重視，先后有實驗證明菊粉[11]、低聚半乳糖[12]、低聚果糖[13]在腸道炎癥的治療/改善中取得了顯著效果。低聚乳果糖(lactosucrose，LS)是一種由蔗糖和乳糖通過糖苷酶合成的功能性三糖，其結構從一側看為乳糖接上一個果糖基[14](圖1)。研究表明LS能促進腸道雙歧桿菌和乳酸菌的增殖，刺激丁酸的產生[15]，同時還具有免疫調節作用：Taniguchi等[16]研究發現LS能抑制小鼠分泌IgE，促進脾細胞分泌抑炎因子白細胞介素10(IL-10)，Hino等[17]用LS飼喂BALB/c小鼠，發現LS能促進派伊爾節分泌轉化生長因子β1和白細胞介素6(IL-6)。IL-10和IL-6是Th2型細胞因子，同時有研究顯示Th1/Th2分化失衡是引起自身免疫疾病(如IBD)的重要因素[18]。綜上，LS可能通過促進Th2型細胞因子分泌調節腸炎大鼠Th1/Th2的平衡，從而達到緩解炎癥的目的。

本實驗以TNBS誘導的IBD模型大鼠為研究對象，通過檢測其對大鼠血漿炎癥介質和Th1/Th2型細胞因子的影響，來探討LS緩解慢性腸道炎癥可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

5%三硝基苯磺酸(TNBS) 美國Sigma公司；柳氮磺胺吡啶(SASP) 北京雙鶴藥業股份有限公司；LS為實驗室自制；堿性磷酸酶(ALP)、乳酸脫氫酶(LDH)、誘生型一氧化氮合酶(iNOS)試劑盒 南京建成生物生物工程研究所；IL-4、IL-10和IFN-γ ELISA檢測試劑盒 上海鑫樂生物科技有限公司。

5418冷凍離心機 德國艾本德股份公司；722型可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司。

1.2 動物

SD雌性大鼠，SPF級，體質量(200±20)g，4～5周齡，購自上海西普樂-必凱實驗動物有限公司，室溫條件下常規飼養。

1.3 方法

1.3.1 低聚乳果糖的制備

以蔗糖和乳糖為底物，利用β-呋喃果糖苷酶的酶液合成低聚乳果糖[19]。蔗糖和乳糖以質量比1:1混合，當底物質量濃度均為0.20g/mL，底物與酶液體積比為1:1，在pH7.0、溫度35℃、反應22.77h，得產物低聚乳果糖，純化，通過HPLC-ELSD法對低聚乳果糖含量進行測定。低聚乳果糖含量為55%。

1.3.2 結腸炎模型的建立及處理

采用TNBS灌腸法制作大鼠UC模型[20]。大鼠適應性喂養3d后，取SD大鼠32只，分為正常組、模型組、LS組、SASP組，每組8只。造模前禁食24h，大鼠用質量濃度為0.01g/mL的戊巴比妥鈉麻醉，用灌胃針頭輕輕從肛門插入，深度約為8cm，正常組大鼠按100mg/kg(以體質量計)灌入蒸餾水，模型組、LS組、SASP組按TNBS劑量為100mg/kg(以大鼠體質量計)，推入TNBS溶液，捏緊肛提尾倒立30s后平放，放回籠中自然蘇醒，術后常規飼養。

正常組和模型組每只大鼠每天分別灌胃生理鹽水2mL，LS組每只每天灌胃含LS的生理鹽水溶液2mL(LS劑量為250mg/(kg·d))，SASP組每只每天灌胃含SASP的生理鹽水溶液2mL(SASP劑量為250mg/(kg·d))，自由飲水，連續飼養21d。

1.3.3 血漿的采集

至第21天，各組大鼠禁食24h后，用斷頭法處死大鼠，取血，加入肝素鈉抗凝，于－80℃超低溫冰箱保藏。

1.3.4 ALP、LDH和iNOS活力的檢測

ALP、LDH、iNOS的活力的檢測嚴格按照試劑盒說明書檢測。

1.3.5 血漿細胞因子含量的檢測

血漿IL-4、IL-10和IFN-γ的含量采用ELISA法檢測，按試劑盒說明書進行檢測。

1.4 統計學分析

2 結果與分析

2.1 低聚乳果糖對TNBS誘導的結腸炎大鼠體質量、采食量的影響

表1 低聚乳果糖對結腸炎大鼠體質量、采食量的影響(±s，n=8)Table 1 Effect of lactosucrose on body weight and food intake(±s，n=8)

表1 低聚乳果糖對結腸炎大鼠體質量、采食量的影響(±s，n=8)Table 1 Effect of lactosucrose on body weight and food intake(±s，n=8)

注：同列小寫字母不同表示差異顯著(P＜0.05)，同列大寫字母不同表示差異極顯著(P＜0.01)。下同。

組別 初始體質量/g 末體質量/g 采食量/g正常組 231.00±4.83 257.76±16.04b 933.66±45.28b模型組 229.92±16.27 235.00±9.53a 790.21±122.45a LS組 229.71±12.29 250.57±14.44b 862.38±46.82ab SASP組 229.35±11.71 251.00±11.29b 940.34±87.93b

前人研究[21]結果顯示，IBD容易引起機體體質量的降低和采食量的下降。由表1可知，和正常組大鼠相比，TNBS誘導的結腸炎大鼠的體質量和采食量顯著降低(P＜0.05)；通過LS或SASP干預后，大鼠的體質量顯著增加(P＜0.05)，且與正常大鼠的體質量無顯著差異性；LS干預后腸炎大鼠的采食量與正常組和模型組相比均無差異顯著性。這一結果說明LS在緩解TNBS誘導的腸道炎癥具有一定的緩解作用。

2.2 低聚乳果糖對TNBS誘導的結腸炎血漿LDH、ALP和iNOS活力的影響

表2 低聚乳果糖對結腸炎大鼠血漿LDH、ALP和iNOS活力的影響(±s，n=8)Table 2 Effect of lactosucrose on the activities of LDH, ALP and iNOS(±s，n=8)

表2 低聚乳果糖對結腸炎大鼠血漿LDH、ALP和iNOS活力的影響(±s，n=8)Table 2 Effect of lactosucrose on the activities of LDH, ALP and iNOS(±s，n=8)

組別 ALP活力/(U/L) LDH活力/(U/L)iNOS活力/(U/mL)正常組 139.67±34.60B 427.67±53.17a 4.57±2.13a模型組 95.80±10.28A 544.75±31.92b 11.05±1.13c LS組 147.83±19.71B 518.43±61.23ab 7.25 ±1.20b SASP組 132.20±18.89B 529.57±98.41ab 7.34±2.79b

由表2可知，TNBS造模后，血漿ALP的活力降低了31.4%，和正常組相比具有極顯著差異性(P＜0.01)，LDH和iNOS的活力顯著增加(P＜0.05)，其中iNOS的活力和正常組相比增加了141.8%。經過LS或SASP干預后，極顯著增加了血漿ALP的活力(P＜0.01)，且恢復到正常水平；iNOS的活力顯著降低(P＜0.05)；LDH的活力與正常組和模型組相比均無差異顯著性。LS組與SASP組相比，無差異顯著性。LS干預后對血漿中與炎癥相關的介質的影響的結果，揭示LS能降低大鼠血漿的炎癥水平。

2.3 低聚乳果糖對TNBS誘導的結腸炎大鼠血漿細胞因子含量的影響

表3 低聚乳果糖對結腸炎大鼠血漿IL-4、IFN-γ和IL-10含量的影響(±s，n=8)Table 3 Effect of lactosucrose on the contents of IL-4, IFN-γ and IL-10(±s，n=8)

表3 低聚乳果糖對結腸炎大鼠血漿IL-4、IFN-γ和IL-10含量的影響(±s，n=8)Table 3 Effect of lactosucrose on the contents of IL-4, IFN-γ and IL-10(±s，n=8)

組別 IL-4 含量/(pg/mL) IFN-γ 含量/(pg/mL)IL-10含量/(pg/mL) IFN-γ/IL-4比值正常組 183.92±19.89C 1050.22±47.91A 48.20±5.12b 6.60±1.20a模型組 130.45±17.75A 1368.48±117.55B 37.33±3.57a 11.29±0.90c LS組 165.38±9.06bBC 1185.87±189.65AB 45.96±7.86b 7.12±1.19ab SASP組 149.60±18.69AB 1202.83±146.59AB 48.92±4.91b 8.28±0.54b

由表3可知，和正常組相比，TNBS誘導的結腸炎大鼠，顯著降低了血漿IL-4(P＜0.01)和IL-10(P＜0.05)的含量，顯著增加了IFN-γ的含量(P＜0.01)以及IFN-γ/IL-4比值(P＜0.05)，其中IFN-γ/IL-4比值增加了71.1%。該模型的結腸炎大鼠用LS膳食干預后，極顯著地促進了IL-4含量(P＜0.01)的產生，且與正常組相比無顯著差異；顯著增加了IL-10的含量(P＜0.05)；顯著降低了IFN-γ/IL-4比值(P＜0.05)；IFN-γ的含量和模型組相比有所降低，但無差異顯著性。LS組和SASP相比，在促進IL-4產生和降低IFN-γ/IL-4比值上，LS甚至優于SASP。以上結果顯示，LS能調節腸炎大鼠血漿免疫水平。

3 討 論

目前關于低聚糖緩解IBD的研究主要集中在局部腸道組織。Videla等[11]研究結果顯示菊粉能顯著降低DSS誘導的結腸炎大鼠結腸黏膜髓過氧化物酶的活力，促進乳酸菌的增殖。Camuesco等[12]研究結果顯示乳果糖顯著降低TNBS誘導的結腸炎大鼠結腸TNF-α含量，iNOS蛋白表達，提高谷胱甘肽過氧化物酶的活力。本實驗組的前期實驗結果顯示低聚乳果糖促進盲腸丁酸的產生[22]。

近年研究發現IBD患者或動物模型均存在不同程度的腸道屏障功能異常，如腸道通透性增加[23]。腸道通透性的增加使得腸腔中內毒素(脂多糖)進入血液循環系統，引起全身性的炎癥反應，導致全身性的低水平的慢性炎癥[24]，因此我們推測IBD的發生對血液炎癥水平造成影響。本實驗主要通過檢測低聚乳果糖干預TNBS誘導的結腸炎大鼠對血漿炎癥水平及免疫細胞因子的影響，探討其可能的作用機制。

本實驗結果表明LS能減輕血漿的炎癥水平。LDH是一種參與糖酵解的重要酶，當機體組織器官發生損傷時，會引起血液中LDH的改變，常用來作為細胞或組織損傷的監測指標。TNBS造模后，模型組LDH的活力顯著高于正常組，而LS干預后乳酸脫氫酶的含量有所降低，但與模型組和正常組均無顯著差異性。說明LS在一定程度上降低了細胞損傷。ALP能非特異性的水解磷酸單酯鍵，其能水解脂多糖的1-磷酸鍵，使其轉變為單磷酞脂A，單磷酞脂A不與膜受體結合，不能刺激機體炎癥反應[25]，因此ALP能降低脂多糖引起的炎癥反應。在正常生理情況下，iNOS表達較低，當內毒素含量增加時iNOS被誘導激活，產生高濃度的NO，使炎癥水平加劇[26]，同時Th1細胞的活化也能刺激iNOS產生[27]。由于ALP能抑制內毒素的毒性，因此ALP活力的增加以及抑制Th1細胞活化能抑制iNOS的活力，緩解炎癥水平。實驗結果顯示，TNBS誘導后血中ALP活力極顯著降低，iNOS的活力顯著升高，說明TNBS造成了血漿炎癥的發生。LS干預后，和模型組相比，LS極顯著提高了ALP的活力，顯著降低了iNOS的活力，說明LS能降低機體炎癥水平。綜上，LS在一定程度上緩解了TNBS誘導的結腸炎大鼠血漿炎癥水平。

Th1/Th2細胞分化失衡在IBD發病機制中起著重要作用[18]。Th1細胞能有效的刺激細胞免疫反應，主要分泌的細胞因子有IFN-γ；Th2細胞主要是刺激體液免疫反應，其分泌的細胞因子主要有IL-4、IL-10等[28]。研究顯示，Th1型細胞誘導iNOS的產生。LS干預后iNOS活力的降低，可能與Th1細胞受到抑制有關。LS的前期研究結果顯示，LS能促進Th2型細胞因子IL-10、IL-6的產生，因此LS能刺激Th2型細胞的活化，而Th2型細胞在功能上與Th1型細胞相互拮抗，推測LS對血漿炎癥水平的緩解可能與Th1/Th2平衡有關。

TNBS誘導的結腸炎模型，其病變部位IFN-γ和IL-12的含量明顯升高，而用抗IL-12抗體治療后可明顯減輕炎癥，說明該模型是由IL-12驅動的Thl反應占優勢的炎癥[29]。本實驗的結果顯示TNBS造模21d后，與正常組相比，模型組顯著增加了Th1型細胞因子IFN-γ的含量以及IFN-γ/IL-4比值，而Th2型細胞因子IL-4和IL-10的含量顯著降低，說明TNBS結腸炎大鼠Th1/Th2平衡向Th1方向移動，Th1型免疫反應占優勢，與前人研究結果一致。LS干預后，IL-4和IL-10顯著增加，同時IFN-γ/IL-4的比值顯著降低且與正常組無顯著差異性，在一定程度上降低IFN-γ的含量，這一結果說明LS對Th2型細胞因子的作用優于Th1型細胞因子，結腸炎大鼠體內Th1型免疫反應得到抑制，Th1/Th2重新得到平衡。

本實驗結果表明LS通過促進Th2型細胞因子的分泌，調節Th1/Th2免疫平衡，從而改善結腸炎大鼠炎癥水平。與SASP相比，LS顯示出了類似的效果，甚至在促進IL-4的產生和調節IFN-γ/IL-4比值，LS稍優于SASP。

[1]LAM Y Y, MITCHELL A J, HOLMES A J, et al.Role of the gut in visceral fat inf lammation[J].Obesity, 2011, 19(11): 2113-2120.

[2]de la SERRE C B, ELLIS C L, LEE J, et al.Propensity to highfat diet-induced obesity in rats is associated with changes in the gut microbiota and gut inflammation[J].Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol, 2010, 299(2): G440-G448.

[3]DING Shengli, CHI M M, SCULL B P, et al.High-fat diet: bacteria interactions promote intestinal inflammation which precedes and correlates with obesity and insulin resistance in mouse[J].PLoS One,2010, 5(8): e12191.

[4]DING Shengli, LUND P K.Role of intestinal inflammation as an early event in obesity and insulin resistance[J].Current Opinion in Clinical Nutrition and Metabolic Care, 2011, 14(4): 328-333.

[5]LOFTUS E V.Clinical epidemiology of inflammatory disease:incidence, prevalence and environmental influences[J].Gastroenterology, 2004, 126(6): 1504-1517.

[6]APDW2004 Chinese IBD Working Group.Retrospective analysis of 515 cases of Crohn’s disease hospitalization in China: Nationwide study from 1990 to 2003[J].Journal of Gastroenterology and Hepatology, 2006, 21(6): 1009-1015.

[7]歐陽欽.炎癥性腸病發病機制與治療研究的最新進展[J].中華消化雜志, 2003, 23(8): 453-454.

[8]FRIEND D R, TOZER T N.Drug glycosides in oral colon-specific drug delivery[J].Journal of Controlled Release, 19(1/3): 109-120.

[9]SCHELLEKENS R C A, STUURMANB fE, van der WEERT fH J, et al.A novel dissolution method relevant to intestinal release behaviour and its application in the evaluation of modified release mesalazine products[J].European Journal of Pharmaceutical Sciences,2007, 30(1): 15-20.

[10]LINARES V, ALONSO V, ALBINA M L, et al.Lipid peroxidation and antioxidant status in kidney and liver of rats treated with sulfasalazine[J].Toxicology, 2009, 256: 152-156.

[11]VIDELA S, VILASECA J, ANTOLíN M, et al.Dietary inulin improves distal colitis induced by dextran sodium sulfate in the rat[J].Am J Gastroenterol, 2001, 96(5): 1486-1493.

[12]CAMUESCO D, PERAN L, COMALADA M, et al.Preventative effects of lactulose in the trinitrobenzenesulphonic acid model of rat colitis[J].Inflamm Bowel Dis, 2005, 11(3): 265-271.

[13]LINDSAY J O, WHELAN K, STAGG A J, et al.Clinical,microbiological, and immunological effects of fructo-oligosaccharide in patients with Crohn’s disease[J].Gut, 2006, 55(3): 348-355.

[14]代志凱, 廖春龍, 印遇龍, 等.高效液相色譜-蒸發光散射法測定酶法合成低聚乳果糖的含量[J].食品科學, 2010, 31(16): 180-183.

[15]ERAMOTO F, ROKUTAN K, KAWAKAM Y I, et al.Effect of 4G-β-D-galactosylsucrose (lactosucrose) on fecal microf lora in patients with chronic inf lammatory bowel disease[J].J Gastroenterot, 1996, 31(1):33-39.

[16]TANIGUCHI Y, MIZOTE A, KOHNO K, et al.Effects of dietary lactosucrose (4G-beta-D-galactosylsucrose) on the IgE response in mice[J].Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 2007, 71(11):2766-2773.

[17]HINO K, KUROSE M, SAKURAI T, et al.Effect of dietarylactosucrose (4G-β-D-galactosylsucrose) on the intestinal immune functions in mice[J].Journal of Applied Glycoscience, 2007, 54(3):169-172.

[18]ZENEWICZ L A, ANTOV A, FLAVELL R A.CD4 T-cell differentiation and inf lammatory bowel disease[J].Trends in Molecular Medicine, 2009, 15(5): 199-207.

[19]廖春龍, 印遇龍, 阮征, 等.β-呋喃果糖苷酶法合成低聚乳果糖工藝優化[J].食品科學, 2011, 32(4): 102-106.

[20]李茹柳, 遲莉, 郭文峰, 等.造模因素對TNBS致大鼠潰瘍性結腸炎模型的影響[J].中藥藥理與臨床, 2007, 23(6): 81-83.

[21]LVILLOSLADA F, DEBRAS E, NIETO A, et al.Oligosaccharides isolated from goat milk reduce intestinal inf lammation in a rat model of dextran sodium sulfate-induced colitis[J].Clinical Nutrition, 2006,25(3): 477-488.

[22]周艷, 彭彰智, 阮征, 等.低聚乳果糖對結腸炎大鼠食糜代謝物影響[J].食品科學, 2011, 32(11): 273-276.

[23]曹霞, 于成功.腸黏膜屏障功能異常與炎癥性腸病[J].胃腸病學,2011, 16(6): 379-381.

[24]ANDREASEN A S, KRABBE K S, KROGH-MADSEN R, et al.Human endotoxemia as a model of systemic inf lammation[J].Current Medicinal Chemistry, 2008, 15(9): 1697-1705.

[25]BENTALA H, VERWEIJ W R, VLAG H A, et al.Removal of phosphate from lipid a as a strategy to detoxify lipopolysaccharide[J].Shock, 2002, 18(6): 561-566.

[26]POSSEL H, NOACK H, PUTZKE J, et al.Selective upregulation of inducible nitric oxide synthase (iNOS) by lipopolysaccharide (LPS)and cytokines in microglia:in vitroandin vivostudies[J].Glia, 2000,32(1): 51-59.

[27]MUNDER M, EICHMANN K, MORáN J M, et al.Th1/Th2-regulated expression of arginase isoforms in murine macrophages and dendritic cells[J].J Immunol, 1999, 163(7): 3771-3777.

[28]MOSMANN T R, SAD S.The expanding universe of T-cell subsets:Th1, Th2 and more[J].Immunology Today, 1996, 17(3): 138-146.

[29]NEURATH B M E, FUSS I, KELSALL B L, et al.Antibodies to IL-12 abrogate established experimental colitis in mice[J].J ExP Med, 1995,182(5): 1281-1290.