花椒精灌胃劑量對去勢大鼠腸道健康的影響

劉慶慶，任文瑾，呂 嬌，劉 雄*

(西南大學食品科學學院，重慶 400715)

花椒是蕓香科(Rutaceae)花椒屬(ZanthoxylumL.)中具有芳香氣味的藥用植物，分布于韓國、中國、日本等國家[1-2]。花椒精是采用科學的物理方法從花椒中提取、精制而成的厚重麻味的天然調味料，主要由花椒非揮發性精油和揮發性精油混合而成。其生產工藝是將新鮮成熟花椒烘干、篩分后取花椒果殼制成花椒粉，花椒粉在多功能提取罐中用浸提劑進行回流浸提，將提取的浸提液濃縮、純化、凈化后得到花椒非揮發性精油，將其與烘干、純化過程中得到的花椒揮發性精油混合即可。

由于花椒精具有花椒特有的麻香味，且可以通過控制花椒精的用量來調節食用油的麻度，因此其是一種高檔的調味品和香料。花椒精不僅是一種高效的食品添加劑，其還具有多種生理功能。花椒揮發油具有麻醉作用，具有較好的抗炎和鎮痛作用[3-4]。有研究表明，花椒精對心血管系統、消化系統、免疫機能、凝血功能等均具有較強的藥理學活性[5]。另外，干信等[6]研究發現，花椒揮發油對實驗用的酵母菌、霉菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌都有明顯的抑制作用。韋敏等[7]研究發現，花椒揮發油對過敏性刺激誘發的哮喘有較好的抑制作用。花椒揮發油還具有較強的抗氧化活性，其抗脂質過氧化活性和清除自由基的能力比VC和VE都強[8]。近年來的研究發現，花椒揮發油還具有抗腫瘤[9]和減少動脈粥樣硬化發病率的作用[10]。

更年期婦女卵巢功能衰退，雌激素分泌逐漸減少，促性腺激素水平升高，易出現植物神經功能紊亂而引起的系列癥候群，其中以血脂和膽固醇升高導致的心血管癥狀為主要臨床表現。雖然用雌激素替代治療可以明顯降低冠心病的發病率和死亡率，但是長期服用雌激素會產生較大的副作用。因此通過膳食來調節和預防更年期婦女的血脂和膽固醇的升高，是一種理想的途徑。花椒精富含抗氧化活性成分，能防止正常低密度脂蛋白(LDL)氧化，預防動脈粥樣性疾病的發生，但尚未見有關花椒精對腸道健康作用的報道。本實驗室前期研究也發現花椒精能有效降低卵巢切除大鼠血脂，本實驗通過選取同種基礎飼料飼喂卵巢偽切除組和卵巢切除組大鼠，隨機選擇3組卵巢切除組灌胃不同灌胃劑量的花椒精，研究花椒精灌胃劑量對卵巢切除手術后大鼠腸道健康的影響。

1 材料與方法

1.1 動物與材料

雌性SD大鼠，清潔級，4周齡，體質量(100±10)g，購自重慶滕鑫比爾實驗動物有限公司，動物許可證號：SCXK(渝)20070008。

表1 花椒精中花椒揮發油的成分及含量Table 1 Composition of the basic diet

花椒精，主要成分為花椒麻素(32.18%)和花椒揮發油(54.64%)，花椒揮發油的成分及含量見表1，購于重慶嬌王花椒股份有限公司；基礎飼料，購于重慶滕鑫比爾實驗動物有限公司；金龍魚大豆油(食用級) 市售。

1.2 試劑

乙醇、氫氧化鈉、氯化鈉、檸檬酸、鎢酸鈉、硫酸、苯酚、硝普鈉、次氯酸鈉(分析純) 成都市科龍化工試劑廠；乙酸、巴豆酸(標準品，純度＞99.7%) 英國Johnson Matthey公司；丙酸、丁酸、異丁酸(標準品，純度＞99%) 梯希愛(上海)化成工業發展有限公司；TPY瓊脂培養基、腸球菌瓊脂(膽汁七葉疊氮鈉瓊脂)、乳酸桿菌選擇性瓊脂、伊紅美藍瓊脂、厭氧菌瓊脂 青島高科園海博生物技術有限公司。

1.3 儀器與設備

PHS-3C精密pH計 上海大普儀器有限公司；JA2003A電子天平 上海精天電子儀器有限司; DHG-9070電熱恒溫鼓風干燥箱 上海齊欣科學有限公司；1-15PK冷凍離心機 美國Sigma公司；WH-1微型漩渦混合器 上海滬西分析儀器廠有限公司；722-P可見分光光度計 上海現科儀器有限公司；GC-2010高效氣相色譜儀 日本島津公司；Stabilwax-DA色譜柱 美國Restek公司；SW-CJ-1FD 潔凈工作臺 蘇州安泰空氣技術有限公司；HH-B11電熱恒溫培養箱 上海躍進醫療器械廠；ES-315高壓蒸汽滅菌鍋 日本Seisakusyo公司。

1.4 方法

1.4.1 實驗設計

40只雌性SD大鼠，室溫保持(25±1)℃，12h明暗輪換(19：00～21：00)，喂食基礎飼料1周，適應喂養環境后，按大鼠體質量隨機分為5組，腹部注射戊巴比妥鈉(無菌生理鹽水配制0.3%溶液，注射量1mL/100g，以體質量計)使其麻醉，對其中1組進行偽切除手術，其余4組進行雙側卵巢切除手術后隨機分組，手術后進行為期1周的恢復后，每天對偽切除組和雙側卵巢切除(OVX)花椒精劑量空白組灌胃大豆油做空白組，對花椒精劑量組分別灌胃含5、10、15mg/mL花椒精的大豆油溶液，灌胃劑量均為0.1mL/100g。所有大鼠均喂食基礎飼料(基礎飼料配方見表2)，自由攝食和飲水，每天稱量大鼠體質量并記錄大鼠采食量。

表2 基礎飼料配方Table 2 Chemical composition and content of zanthocylum essential oil

實驗周期為4周，實驗期最后1d斷糧12h，19：00～21：00乙醚麻醉后斷頭處死大鼠，取出盲腸組織，稱質量。將盲腸組織縱向剪開，稱取0.2g左右盲腸內容物，加入10倍去離子水，用旋渦混合儀混勻，電子pH計測其pH值；稱取0.5g左右盲腸內容物放入超純水處理過的10mL離心管中，立即加入2mL含有5mmol/L巴豆酸的10mmol/L氫氧化鈉溶液，充分混勻后冷藏用于短鏈脂肪酸檢測。稱取0.3g左右盲腸內容物放入預先恒定質量的鋁盒中，105℃條件下恒定質量測定其水分含量。稱取0.3g左右盲腸內容物，加入10倍(V/m)無氨水，－20℃冷凍待測游離氨。剩余盲腸內容物收集于10mL離心管中，－80℃冷凍保存，用于測定盲腸內容物中微生物含量。

1.4.2 飼料效率的測定[11]

實驗前測定每只大鼠的體質量，實驗期間每天記錄采食量，實驗結束時測定每只大鼠體質量。計算出4周的實驗期內大鼠體質量增加量和總的飼料采食量。

1.4.3 盲腸內容物質量的測定

盲腸內容物質量/g=盲腸總質量/g－盲腸壁質量/g (2)

1.4.4 盲腸內容物含水率測定

稱取一定質量的新鮮盲腸內容物，放入預恒質量鋁盒中，105℃質量恒定，測其含水量。

式中：m1為盲腸內容物濕質量/g；m2為盲腸內容物干質量/g。

1.4.5 盲腸內容物pH值測定

稱取一定質量的新鮮盲腸內容物于10mL去離子水預處理離心管中，加入10倍(V/m)去離子水，旋渦混合儀上混勻后靜置，測上清液pH值。

1.4.6 盲腸內容物游離氨測定

無氨水制備：在1000mL蒸餾水中加入0.10mL硫酸(ρ=1.84g/mL)，并在全玻璃蒸餾器中重蒸餾，棄去前50mL蒸出液，然后將蒸出液收集在帶有玻璃塞的玻璃瓶中。

將預處理的盲腸內容物樣品4000r/min條件下離心5min，吸取上清液1mL，依次加入1mL含有0.001mol/L亞硝基鐵氰化鈉的0.5mol/L苯酚溶液和1mL含有0.03mol/L次氯酸鈉的0.625mol/L氫氧化鈉溶液，60℃保溫7min，于625nm波長處測吸光度[12]。

1.4.7 盲腸壁表面積測定[13]

用冰冷生理鹽水洗凈盲腸，充分展開后固定在A4紙上，勾出其輪廓，待紙干燥后將盲腸壁輪廓復寫在厚的打印紙上，然后將紙上的盲腸輪廓圖剪下。用精密度為0.0001g的電子秤準確稱量輪廓圖紙質量(m2)和1cm2的打印紙質量(m1)，然后按式(4)計算盲腸表面積。

1.4.8 盲腸內容物中SCFA測定

將預處理的盲腸內容物樣品在4℃、4000r/min離心15min，吸取上清液轉移至預先用純水處理過的10mL離心管中，10000r/min轉速下繼續離心15min，1mL一次性注射器吸取上清液1mL，0.25μm濾膜過濾至2mL進樣小瓶中待測。

氣相色譜條件：進樣量1μL；進樣口溫度220℃；柱流量0.95mL/min，柱溫90℃，平衡時間0.5min，5℃/min升溫至150℃，保留時間7min；檢測器溫度230℃；氫氣流量40mL/min，空氣流量400mL/min，尾吹流量40mL/min[14]。

1.4.9 盲腸內容物微生物測定

取－80℃冷凍盲腸內容物0.2g左右，加入9倍(V/m)無菌生理鹽水，旋渦混合儀振蕩混勻，制得10-1稀釋度盲腸內容物。依次10倍稀釋至10-12稀釋度，選擇10-1、10-2、10-33個稀釋度，用于大腸桿菌和腸球菌的培養計數；選擇10-4、10-5、10-63個稀釋度，用于雙歧桿菌和乳酸桿菌的培養計數，選擇10-2、10-3、10-43個稀釋度，用于厭氧菌的培養計數，接種量為200μL。大腸桿菌培養選用EMB培養基，37℃條件恒溫培養箱中培養36～48h計數。雙歧桿菌、乳酸桿菌和厭氧菌分別選用TPY瓊脂、乳酸桿菌選擇性瓊脂和厭氧菌瓊脂培養基，37℃條件下二氧化碳細胞培養箱中厭氧培養48～72h計數。結果以lg(CFU/g)表示。

1.5 統計分析

采用SPSS Statistics(版本17.0)軟件對結果進行統計分析，實驗數據以±s表示；各組結果采用Duncan’s顯著性差異測驗進行單向方差分析，顯著水平為0.05。

2 結果與分析

2.1 花椒精灌胃劑量對去勢大鼠體質量增加量、飼料采食量和飼料效率的影響

表3 花椒精灌胃劑量對去勢大鼠體質量增加量、飼料采食量和飼料效率的影響(±s，n=8)Table 3 Effect of Zanthoxylum essential oil dose on body weight gain,total feed intake and feed efficiency of ovariectomized rats(±s，n=8)

表3 花椒精灌胃劑量對去勢大鼠體質量增加量、飼料采食量和飼料效率的影響(±s，n=8)Table 3 Effect of Zanthoxylum essential oil dose on body weight gain,total feed intake and feed efficiency of ovariectomized rats(±s，n=8)

注：*.偽切除組與空白組相比，存在顯著性差異(P＜0.05)。下同。

項目 偽切除組 空白組 劑量組5mg/(kg·d) 10mg/(kg·d) 15mg/(kg·d)體質量增加量/(g/4周)80.25±13.67* 141.00±10.60 133.25±12.20 137.88±25.67 129.75±13.99采食量/(g/4周) 538.50±47.16* 611.00±31.79 630.13±37.81 631.88±58.65 640.00±64.13飼料效率/(g/100g)14.89±2.09* 22.64±1.84 21.21±2.30 21.77±3.16 20.38±2.38

由表3可知，空白組與偽切除組相比，卵巢切除使得大鼠的體質量增加量、采食量及飼料效率均顯著增加(P＜0.05)。在卵巢切除組中，灌胃不同劑量花椒精的大鼠體質量增加量、采食量和飼料效率與空白組之間差異不顯著。

2.2 花椒精灌胃劑量對大鼠盲腸總質量、盲腸壁濕質量、表面積以及盲腸內容物濕質量的影響

表4 花椒精灌胃劑量對去勢大鼠盲腸總質量、盲腸壁質量和表面積以及盲腸內容物濕質量的影響(±s，n=8)Table 4 Effect of Zanthoxylum essential oil dose on caecal weight, wet weight and area of the ceacal wall, and wet weight of the caecal contents in ovariectomized rats (±s，n=8)

表4 花椒精灌胃劑量對去勢大鼠盲腸總質量、盲腸壁質量和表面積以及盲腸內容物濕質量的影響(±s，n=8)Table 4 Effect of Zanthoxylum essential oil dose on caecal weight, wet weight and area of the ceacal wall, and wet weight of the caecal contents in ovariectomized rats (±s，n=8)

注：上標字母不同表示灌胃組間存在顯著性差異(P＜0.05)。下同。

項目 偽切除組 空白組 劑量組5mg/(kg·d) 10mg/(kg·d) 15mg/(kg·d)盲腸總質量/g 4.37±1.00 5.28±1.65 5.60±0.65 5.29±1.76 5.37±0.96盲腸壁濕質量/g 1.01±0.10 1.15±0.15 1.16±0.08 1.20±0.22 1.19±0.10盲腸表面積/cm2 21.31±2.30* 24.83±3.90ab23.51±3.36a 27.22±3.78b 26.09±2.59ab內容物濕質量/g 3.36±0.99 4.13±1.53 4.43±0.62 4.09±1.62 4.18±0.89壁濕質量/體質量/% 0.39±0.04 0.35±0.02 0.36±0.02 0.36±0.03 0.37±0.03

由表4可知，空白組與偽切除組相比，盲腸表面積顯著增大(P＜0.05)，盲腸總質量、內容物濕質量和盲腸壁濕質量均呈上升趨勢；各劑量組與空白組相比，壁濕質量/體質量百分比、盲腸總質量及盲腸壁濕質量都呈現上升趨勢。

2.3 花椒精灌胃劑量對大鼠盲腸內容物水分含量、pH值和游離氨含量的影響

表5 花椒精灌胃劑量對去勢大鼠盲腸內容物水分含量、pH值和游離氨含量的影響(±s，n=8)Table 5 Effect of Zanthoxylum essential oil dose on pH, water content and ammonia level of the caecal contents in ovariectomized rats rats(±s，n=8)

表5 花椒精灌胃劑量對去勢大鼠盲腸內容物水分含量、pH值和游離氨含量的影響(±s，n=8)Table 5 Effect of Zanthoxylum essential oil dose on pH, water content and ammonia level of the caecal contents in ovariectomized rats rats(±s，n=8)

項目 偽切除組 空白組 劑量組5mg/(kg·d) 10mg/(kg·d) 15mg/(kg·d)內容物含水率/% 81.32±4.49 80.11±5.20 79.54±3.03 77.92±1.44 79.96±3.76盲腸內容物pH 8.17±0.31 8.10±0.35 8.07±0.18 8.09±0.18 8.04±0.30游離氨含量/(μg/g)203.69±15.34*257.76±29.29253.13±30.77238.55±20.57228.59±17.29

由表5可知，空白組與偽切除組相比，盲腸內容物中游離氨含量顯著升高(P＜0.05)，盲腸內容物含水率及內容物pH值均呈下降趨勢，未達到顯著水平；各劑量組與空白組相比，盲腸內容物含水率及pH值均無顯著差異，游離氨濃度的變化趨勢與灌胃劑量呈負相關。

2.4 花椒精灌胃劑量對去勢大鼠盲腸內容物中短鏈脂肪酸含量的影響

由表6可知，空白組與偽切除組相比，卵巢切除使乙酸、丙酸、丁酸和SCFAs增加，均無顯著性影響(P＞0.05)，但能顯著增加異丁酸含量(P＜0.05)；劑量組中，隨著灌胃劑量的增加卵巢切除大鼠盲腸內容物中的乙酸和丙酸含量逐漸增加，花椒精灌胃劑量為15mg/(kg·d)組與5mg/(kg·d)組相比大鼠盲腸內容物中乙酸、丙酸和SCFAs的含量顯著增加，灌胃劑量為10mg/(kg·d)組和15mg/(kg·d)組與空白組相比SCFAs含量增加，且變化趨勢與灌胃劑量呈正相關。

表6 花椒精灌胃劑量對去勢大鼠盲腸內容物中短鏈脂肪酸含量的影響(±s，n=8)Table 6 Effect of Zanthoxylum essential oil dose on SCFA in the caecal contents of ovariectomized rats (±s，n=8)

表6 花椒精灌胃劑量對去勢大鼠盲腸內容物中短鏈脂肪酸含量的影響(±s，n=8)Table 6 Effect of Zanthoxylum essential oil dose on SCFA in the caecal contents of ovariectomized rats (±s，n=8)

μmol/g有機酸 偽切除組 空白組 劑量組5mg/(kg·d)10mg/(kg·d)15mg/(kg·d)乙酸 11.83±0.0511.91±0.03ab11.78±0.03a11.94±0.14ab12.03±0.21b丙酸 3.52±0.03 3.56±0.03ab 3.50±0.03a 3.59±0.08ab 3.67±0.10b異丁酸 4.76±0.01* 4.78±0.01a 4.76±0.01b 4.78±0.02a 4.77±0.01ab丁酸 3.92±0.03 3.97±0.04 3.92±0.05 4.00±0.08 4.02±0.11 SCFAs 24.04±0.1024.22±0.08ab23.98±0.10a24.31±0.31ab24.50±0.48b

2.5 花椒精灌胃劑量對去勢大鼠盲腸內容物中微生物的影響

表7 花椒精灌胃劑量對去勢大鼠盲腸內容物中微生物的影響(±s，n=8)Table 7 Effect of Zanthoxylum essential oil dose on caecal microflora in ovariectomized rats (±s，n=8)

表7 花椒精灌胃劑量對去勢大鼠盲腸內容物中微生物的影響(±s，n=8)Table 7 Effect of Zanthoxylum essential oil dose on caecal microflora in ovariectomized rats (±s，n=8)

lg(CFU/g)微生物 偽切除組 空白組 劑量組5mg/(kg·d)10mg/(kg·d)15mg/(kg·d)雙歧桿菌 8.88±0.32*9.74±0.67 9.47±0.61 9.24±0.42 9.40±0.43乳酸菌 8.26±0.37*8.77±0.12a8.78±0.53a8.94±0.29ab 9.29±0.38b厭氧菌 7.18±0.23*7.60±0.05a8.42±0.10b 7.18±0.30c 6.81±0.04d大腸桿菌 6.68±0.17*7.26±0.31a6.40±0.35b 6.20±0.77b 6.59±0.17b腸球菌 7.02±0.17*7.32±0.38a5.80±0.13b 6.61±0.18c 6.79±0.54c

由表7可知，與偽切除組組相比，空白組大鼠盲腸內容物中的雙歧桿菌、乳酸菌、大腸桿菌、腸球菌和厭氧菌菌落數量均顯著增加(P＜0.05)。在卵巢切除各組中，乳酸菌菌落數量呈上升趨勢，灌胃劑量為15mg/(kg·d)組較空白組顯著增加；空白組雙歧桿菌菌落數量高于其他劑量組，且均未達到顯著水平；灌胃劑量為10mg/(kg·d)和15mg/(kg·d)組厭氧菌菌落數量均顯著低于空白組(P＜0.05)，但灌胃劑量為5mg/(kg·d)組厭氧菌菌落數量顯著增加(P＜0.05)；與空白組相比，卵巢切除其他各組大腸桿菌和腸球菌菌落數量顯著下降(P＜0.05)。

3 結論與討論

本研究的主要目的是探討花椒精對去勢大鼠腸道健康的影響。從本研究結果看，花椒精能抑制腸道中大腸桿菌及腸球菌等有害菌的生長，減少了游離氨的生成，使腸道pH值下降；花椒精促進了腸道中乳酸菌的生長，雙歧桿菌數量下降但總體達到了相對穩定的水平，10mg/(kg·d)組和15mg/(kg·d)組SCFAs呈上升趨勢，但與花椒精灌胃劑量無關。腸道健康的改善與增加短鏈脂肪酸SCFAs產量、降低腸道pH值、降低腸道中氨和苯酚濃度、降低腸道中次級膽汁酸分泌、減少排空時間和改善細菌活性等方面相關[15]。腸道微生物對維持腸道正常的生理功能具有重要作用，在機體中未消化的多糖、低聚糖、蛋白質、肽和糖蛋白等食物殘渣進入大腸，被腸道微生物進一步分解發酵，糖類發酵產生乙酸、丙酸、丁酸等短鏈脂肪酸和CO2、CH4、H2等氣體，含氮化合物被微生物發酵產生游離氨、苯酚等產物，因此進入大腸的食物殘渣成分直接影響腸道發酵產物和腸道菌群的分布，如膳食纖維多為益生因子，有利于腸道中乳酸菌及雙歧桿菌的生長，產生豐富的SCFAs改善腸道pH值，促進腸細胞生長，抑制結腸癌等。氨是不消化蛋白質在結腸內腐敗的主要產物，它能改變結腸表皮細胞的形態和代謝，被認為是結腸內潛在的腫瘤促進因子，游離氨主要是由小腸中谷氨酰胺代謝產生[16]，大腸微生物代謝也可以產生[17-19]。另外，一部分游離氨在大腸中可被用于細菌蛋白質的合成[20]。綜合有害菌數量、游離氨、pH值及SCFAs含量的變化可以看出，花椒精能促進大鼠腸道的發酵作用，對去勢大鼠腸道健康有益。本研究對于開發花椒精功能性食品具有一定的參考價值，對于花椒精促進腸道健康的機理的研究有更為深遠的意義，還有待進一步研究。

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