發(fā)酵輪葉黨參皂苷對二乙基亞硝胺致小鼠肝細胞DNA氧化損傷的保護作用機制

俞 星，鄭春姬，韓春姬,,*，姜國哲，崔成弼

(1.延邊大學醫(yī)學院預防醫(yī)學教研部，吉林 延吉 133002；2.延邊大學食品研究中心，吉林 延吉 133002)

二乙基亞硝胺(diethylnitrosamine，DEN)是一種很強的化學致癌物，通常用于原發(fā)性肝癌動物模型的制作，可用于研究肝癌的發(fā)病機理及其防治。DEN誘發(fā)小鼠肝癌模型，其特點為誘癌成功率高，肝癌細胞所占比例大[1]，且其誘發(fā)的腫瘤多為肝細胞癌，與人肝細胞癌相似[2-3]。DEN誘發(fā)大鼠肝癌的過程要經過3個階段，即肝硬變前期(1～8周)、肝硬變期(8～14周)、癌變期(14～20周)[4]。

輪葉黨參(Codonopsis lanceolata)又名山海藻，屬于桔梗科黨參屬植物，廣泛分布于中國、韓國、朝鮮、日本等地。輪葉黨參主要是作為山野菜食用，未見任何毒副作用。現代藥理學研究表明，輪葉黨參提取物具有抗氧化、抗衰老、抗突變、抗腫瘤、抗疲勞以及提高機體免疫力等作用[5-8]。本實驗室前期的研究結果表明，輪葉黨參提取物具有顯著的預防化學性肝損傷的作用[9-10]。最近的研究結果表明，輪葉黨參經活性酵母發(fā)酵后，其抗氧化活性明顯增強[11]，但有關輪葉黨參對化學致癌物DEN的早期肝臟損傷的保護作用尚未見報道。本實驗旨在探討發(fā)酵輪葉黨參皂苷(fermentedCodonopsis lanceolatasaponin，FCLS)對DEN致小鼠肝細胞氧化損傷的保護作用及其機制，以期能為肝癌化學預防劑的開發(fā)提供參考數據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

輪葉黨參采集自吉林省延邊州安圖縣。

DEN 日本半井化學藥品株式會社；肝細胞中的細胞色素P4502E(CYP2E)抗體、二氨基聯苯胺(DAB)試劑盒、SABC免疫組化試劑盒 武漢博士德生物工程有限公司；小鼠8羥基脫氧鳥苷(8-OHdG)ELISA試劑盒、8-羥基鳥嘌呤-DNA糖苷酶(OGG1)ELISA試劑盒 上海研生生物科技有限公司，其他試劑均為市售分析純。

1.2 儀器與設備

DG5033A酶聯免疫檢測儀 南京華東電子集團醫(yī)療裝備有限責任公司；小動物IVC飼養(yǎng)系統(tǒng) 蘇杭科技器材有限公司；BM-VI生物組織冷凍包埋機 孝感電子儀器廠；RM2125切片機 萊卡公司；BH2生物顯微鏡日本Olympus公司。

1.3 方法

1.3.1 FCLS的制備

輪葉黨參采用活性酵母發(fā)酵，FCLS的制備方法同俞星等[12]的報道。新鮮輪葉黨參，洗凈浮土，切成2～3cm薄片，在60℃條件下烘干，粉碎成20目的粗粉，用活性酵母發(fā)酵6d[13]，用50%乙醇加熱回流提取，濾液回收乙醇后減壓濃縮，用乙酸乙酯萃取后再用正丁醇萃取，將后者上D10l大孔吸附樹脂，依次用30%、50%、75%和95%乙醇洗脫，合并洗脫液，回收乙醇，減壓干燥得到FCLS，采用香草醛-冰醋酸比色法測定總皂苷含量達到63%，其主要成分為Codonolaside、Lancemaside、刺囊酸等五環(huán)三萜類皂苷，其苷元為齊墩果酸。輪葉黨參經活性酵母發(fā)酵之后，總皂苷含量達到7.34%(未發(fā)酵輪葉黨參總皂苷含量為3.52%)，故本實驗采用發(fā)酵方法處理后提取總皂苷。

1.3.2 動物分組及處理

雄性清潔級昆明種小鼠50只，體質量20～22g，由延邊大學實驗動物科提供，在本實驗室IVC系統(tǒng)中飼養(yǎng)并進行實驗。實驗前先將動物適應性喂養(yǎng)3d，然后隨機分為陰性對照組、單純DEN組(隔日腹腔注射DEN 20mg/kg，以體質量計)、FCLS高、中、低3個劑量組(分別灌胃200、100、50mg/(kg·d)，以體質量計)，連續(xù)6周。

1.3.3 OGG1活性及8-OHdG含量測定

在最后1次給藥后過24h，脫頸椎處死小鼠，每只小鼠取100mg左葉肝組織，加0.9mL生理鹽水用冰浴勻漿，3000×g離心30min后取上清液，嚴格按試劑盒說明書進行操作。肝組織勻漿蛋白含量采用考馬斯亮藍法測定。

1.3.4 肝組織中CYP2E1免疫組織化學染色

動物脫頸椎處死后，取肝臟。切取長寬不超過5mm，厚度不超過2mm的組織塊，用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片。CYP2E1表達的免疫組織化學染色，采用鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化酶免疫組織化學法(SP法)，DAB顯色，一抗CYP2E-BAl774為兔來源的多克隆抗體，工作濃度為1:100，操作嚴格按試劑盒說明書進行。每次實驗均設陰性對照，以PBS替代一抗，于光學顯微鏡下觀察結果。

結果評定標準：CYP2E1陽性細胞表現為胞漿/胞膜呈棕黃色。每份切片取5個高倍視野(×400)，按以下方法進行半定量的計數方法：0級為陽性細胞數為0%～5%，Ⅰ級為陽性細胞數為6%～25%或染色強度較弱，棕褐色不明顯。Ⅱ級為陽性細胞數為26%～50%，染色強度較深，棕褐色較明顯。Ⅲ級為陽性細胞數＞50%，染色強度深，棕褐色明顯。

1.4 統(tǒng)計學分析

用SPSS17.0軟件進行數據分析，計量資料的顯著性檢驗采用單因素方差分析，組間比較采用LSD-t檢驗。CYP2E1表達結果顯著性檢驗采用秩和檢驗。

2 結果與分析

2.1 小鼠肝組織8-OHdG、OGG1含量

表1 各組肝勻漿中8-OHdG含量及OGG1活性比較(±s，n=10)Table 1 Comparison of 8-OHdG content and OGG1 activity in hepatic tissue from different groups (±s，n=10)

表1 各組肝勻漿中8-OHdG含量及OGG1活性比較(±s，n=10)Table 1 Comparison of 8-OHdG content and OGG1 activity in hepatic tissue from different groups (±s，n=10)

注：*.與陰性對照組比較，有顯著性差異(P＜0.05)；#.與DEN組比較，有顯著性差異(P＜0.05)；##.與DEN組比較，有極顯著性差異(P＜0.01)。

組別 8-OHdG含量/(ng/L) OGG1含量/(pg/mL)陰性對照組 38.699±5.959 18.994±4.231 DEN組 54.979±4.688** 13.368±0.600*FCLS低劑量組 50.963±15.313 16.552±1.420##FCLS中劑量組 46.579±4.208## 18.026±3.705#FCLS高劑量組 45.488±2.360## 19.841±2.779##

由表1可知，DEN組肝組織勻漿中8-OHdG含量明顯高于陰性對照組(P＜0.01)；FCLS高、中劑量組肝組織8-OHdG含量明顯低于DEN組，其差異極顯著(P＜0.01)，并隨著FCLS劑量的增高，8-OHdG含量也隨之減少。DEN組肝組織勻漿中OGG1含量明顯低于陰性對照組(P＜0.05)，FCLS高、中、低3個劑量組肝組織勻漿中OGG1含量明顯高于DEN組，其差異顯著(P＜0.05或P＜0.01)，給藥劑量與OGG1活性呈劑量-效應關系。

2.2 肝組織CYP2E1表達

圖1 小鼠肝臟CYP2E1蛋白表達(SP，×400)Fig.1 Expression of CYP2E1 protein in hepatic tissue (SP，×400)

免疫組化顯示棕黃色顆粒為CYP2E1蛋白表達陽性。由圖1可知，在陰性對照組中CYP2E1表達陽性細胞在腺泡Ⅲ區(qū)分布很少，單純給予DEN組CYP2E1表達陽性細胞從腺泡Ⅲ區(qū)延伸到腺泡Ⅱ區(qū)，而給予高劑量和中劑量FCLS的兩個組CYP2E1表達陽性細胞主要分布在腺泡Ⅲ區(qū)。統(tǒng)計評定結果如表2所示，DEN組肝組織中CYP2E1蛋白表達陽性率明顯高于陰性對照組(P＜0.01)；FCLS中劑量組和高劑量組肝組織CYP2E1蛋白表達陽性率明顯低于DEN組，差異顯著(P＜0.05或P＜0.01)。

表2 肝組織中CYP2E1蛋白表達的變化Table 2 Comparison of CYP2E1 protein expression in hepatic tissue from different groups

3 討 論

有研究報道[14]，在DEN誘發(fā)小鼠肝癌實驗中，給予DEN第4、6周時，小鼠肝癌干細胞標志CD133 mRNA的表達與對照組無差異，第8周CD133 mRNA的表達顯著高于對照組，因此DEN誘發(fā)小鼠肝癌的過程中，第1～6周的病理變化主要是藥物性肝炎的表現，包括部分肝細胞出現增生性改變，局部肝細胞的變性壞死和充血及出血。此階段尚未形成肝癌細胞，應是肝癌預防的最佳階段。本實驗的前期研究結果表明輪葉黨參皂苷能明顯提高腹腔注射DEN 6周的小鼠肝組織超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物(GSH-Px)活性，并顯著降低MDA含量，并減少DEN所致肝細胞DNA鏈斷裂[15]，表明FCLS具有明顯的提高抗氧化酶活性作用。8-OHdG是鳥嘌呤的氧化型，是由于DNA鏈上鳥嘌呤堿基的C-8位受到羥自由基及單線態(tài)氧的攻擊，發(fā)生羥化而生成[16-17]，其結果導致G:C突變?yōu)門:A的DNA堿基顛換[18]。在臨床和實驗中8-OHdG常用作檢測DNA氧化損傷、突變的重要生物標志物[19]。本研究結果表明，小鼠隔日注射DEN，連續(xù)6周，導致肝組織8-OHdG含量明顯高于對照組，表明DEN導致小鼠肝細胞DNA氧化損傷。給予DEN的同時灌胃不同劑量的FCLS，肝組織8-OHdG含量明顯低于單純DEN組，且存在劑量依存性，表明FCLS能夠拮抗DEN對肝細胞DNA的氧化損傷作用。由于DEN已被證明誘發(fā)動物肝硬變及肝癌，因此可推測FCLS對DEN誘發(fā)肝癌具有潛在的預防作用。

當DNA分子受自由基攻擊而發(fā)生氧化損傷時，機體可通過自身修復機制修補受損的DNA分子，從而維持DNA的穩(wěn)定性。機體內多種DNA氧化損傷修復方式中堿基切除修復是最重要的修復途徑，因為自由基主要引起非烷基化DNA損傷，該損傷的修復需要堿基切除修復酶。OGG1是參與堿基切除修復過程的重要酶之一，并且在修復的過程中與個體對致癌物作用的敏感性密切相關。無論是OGG1基因突變或缺失，都能使細胞修復8-OHdG的能力降低或喪失，并且對個體患腫瘤的風險也隨之增高[20]。頭頸部鱗狀細胞癌患者OGG1基因表達顯著低于健康人，且OGG1基因表達降低可使患頭頸部鱗狀細胞癌的風險提高2倍以上[21]。本研究結果表明，單純DEN組小鼠肝組織OGG1活性明顯低于陰性對照組，而給予FCLS的小鼠肝組織OGG1活性明顯高于單純DEN組，表明DEN抑制小鼠肝細胞OGGl活性，減弱對氧化損傷的DNA的修復能力。用FCLS干預后通過上調OGGl的活性，提高切除DNA雙鏈中的8-OHdG，恢復基因組中正常的G:C配對，使受損DNA得到修復。本研究結果中，FCLS高劑量組的OGG1活性略高于正常對照組，但其差異無統(tǒng)計學意義，因此認為FCLS在本實驗條件下不發(fā)生OGG1過表達。

細胞色素P450(CYP)是研究較多的Ⅰ相代謝酶，作為肝臟主要代謝酶，該酶系有100多種同工酶，其中細胞色素P4502E1(CYP2E1)約占P450總量的7%，CYP2E1作為肝臟的重要代謝酶參與其發(fā)生發(fā)展，對乙醇、亞硝胺等肝毒性物質具有特異性的代謝作用，但其過表達可促進各種肝病的發(fā)生，并參與了多種消化道和呼吸道腫瘤的形成[22]。在外源性化合物和藥物代謝的過程中，CYP2E1可把無活性的前致癌物代謝轉變?yōu)橛H電子化學物，親電子化學物可以攻擊細胞內的大分子，與DNA或蛋白質形成加成物，最終引起病變[23]。研究表明，CYP2E1參與肝毒性物質的活化，使前毒性物質或致癌物質與嗜電子衍生物結合，引起細胞毒性、死亡甚至癌變[24]。

本研究結果表明，與陰性對照組相比，DEN組細胞的CYP2E1蛋白表達增加，CYP2E1活性增強。該結果證實了DEN誘導CYP2E1蛋白在細胞內的表達，使CYP2E1活性增強，進而使細胞內的脂質過氧化增加，抗氧化物質減少。與DEN組相比，同時給予FCLS組肝細胞CYP2E1蛋白表達降低，說明FCLS可以抑制DEN誘導的CYP2E1活性的上調引起的反應性氧自由基產生的增多及其引起的代謝毒性。

Kim等[25]報道，用乳酸菌發(fā)酵輪葉黨參前后的提取物對人類癌細胞生長抑制作用表現出明顯的差異，即生輪葉黨參提取物對人胃癌及乳腺癌細胞的生長抑制作用優(yōu)于發(fā)酵輪葉黨參提取物，而發(fā)酵輪葉黨參提取物對人肝癌和肺癌細胞的生長抑制作用明顯優(yōu)于生輪葉黨參，并認為其抑癌作用主要依賴于三萜皂苷。俞星等[12]用活性酵母發(fā)酵輪葉黨參后提取總皂苷，進行體外實驗結果表明，輪葉黨參總皂苷能明顯抑制人肝癌細胞HepG-2的增殖，并通過提高促進凋亡基因蛋白Caspase3,8,9活性，誘導HepG-2細胞凋亡。通過本次研究及已有的研究，認為經過活性酵母發(fā)酵的輪葉黨參總皂苷提取物。本次實驗結果表明輪葉黨參經活性酵母發(fā)酵提取的輪葉黨參皂苷對DEN誘發(fā)小鼠肝細胞DNA氧化損傷具有較好的預防作用，提示輪葉黨參通過微生物發(fā)酵，其皂苷對肝癌具有一定的預防作用。關于輪葉黨參經微生物發(fā)酵后某些藥理活性的變化機制尚未見研究報道，有待于今后進一步研究。

綜上所述，FCLS預防DEN致小鼠肝細胞DNA損傷的機制為通過降低CYP2E1活性，降低DEN在肝組織中的活化，通過提高抗氧化酶活性，清除DEN代謝過程中產生的過多的自由基和活性氧，從而阻止了肝細胞DNA的氧化損傷。同時通過提高OGG1基因表達，迅速清除DNA氧化損傷產生的加合物8-OHdG，修復受損DNA。

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