刺孢吸水鏈霉菌發酵液的化學成分及抗炎活性研究

楊曉軍，高 芬

1延安大學化學與化工學院;2延安大學附屬醫院，延安 716000

刺孢吸水鏈霉菌是從陜西省定邊縣酸性土壤中分離得到的一株放線菌。針對放線菌細胞內外次級代謝產物通常不同的特點［1］，本文在研究其菌絲體化學成分的基礎上［2］，又對其發酵液的化學成分進行了研究，從中分離得到5個化合物，利用IR、NMR和MS等方法對其結構進行了解析，分別鑒定為芒柄花素 (1)，N-乙酰基-2-(4-羥苯基)乙胺(2)，阿魏酸(3)，3，4，5-三甲基-1，2-苯二酚(4)7，3'-二羥基-4'-甲氧基黃酮(5);此外，還對分離得到的單體化合物1、2、4和5進行了初步抗炎實驗研究，現報告如下:

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和培養基

實驗菌株分離自中國陜西省定邊縣酸性土壤中，由延安大學生命科學院微生物研究所任桂梅教授利用16SrRNA基因序列分析法鑒定為刺孢吸水鏈霉菌Streptosporangium hygroscopicus n.sp.。

種子培養基:淀粉24 g，葡萄糖1 g，蛋白胨3 g，牛肉膏 3 g，酵母膏 5 g，CaCO34 g，水 1000 mL，pH 6.5。

發酵培養基:大豆粉20 g，蛋白胨2 g，葡萄糖20 g，淀粉 5 g，酵母膏 2 g，NaCl 4 g，K2HPO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，CaCO32 g，水 1000 mL，pH 6.5，28 ℃，培養 120 h。

1.1.2 儀器和其它材料

XRC-1型顯微熔點儀;IR Prestige-21紅外光譜儀(日本島津公司);AV-500型核磁共振儀 (瑞士Bruker公司);MAT-711型質譜儀(美國Thermo公司);Vario EL有機元素分析儀(德國Elementar公司);1525型HPLC(Waters公司);Sephadex LH-20(Pharmacia產品);YLS-7A足趾容積測量儀(山東省醫學科學院設備站);柱層析硅膠100～200目(青島海洋化工廠產品)。CD大鼠，體重90～110 g，由西安交通大學實驗動物中心提供，合格證號NO:0003240，許可證號:SCXK(陜)2007-001.;交叉菜膠(美國Sigma公司產品)。陽性對照組(復方七葉皂苷鈉凝膠，批號:20100953)山東綠葉制藥有限公司.

1.2 方法

1.2.1 發酵方法

將生長良好的斜面接種于種子培養基，28℃、300 rpm搖床培養48 h，再接種于發酵培養基，接種量為1∶10，置于28℃、300 rpm搖床培養120 h。

1.2.2 提取與分離

將發酵120 h的發酵液以3 000 rpm離心，得上清液和菌絲體兩部分，上清液過裝有 Amberlite XAD-16型大孔吸附樹脂的固相萃取柱，然后依次用甲醇和丙酮洗脫吸附在大孔吸附樹脂上的次級代謝產物，將甲醇洗脫液減壓濃縮蒸干，獲得淺黃色粗浸膏，粗樣品用水溶解，溶解部分用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯萃取部分經過減壓濃縮后拌硅膠(200～300目)、晾干、上硅膠柱分離，以氯仿∶甲醇(V∶V)=20∶1→18∶1→16∶1→14∶1→12∶1→10∶1→8∶1→6∶1→4∶1梯度洗脫并分段收集得組分C、D和E。將組分C、D和E繼續上Sephadex LH-20凝膠柱，丙酮為洗脫劑進行純化，各流分以HPLC(C-18色譜柱，4.6 mm ×150 mm，5 μm)檢測其純度。從組分C中分離得到化合物2和4;從組分D中分離得到化合物1和5;從組分E中分離得到化合物3。

1.2.3 化合物1、2、4和5對交叉菜膠致大鼠足趾腫脹的影響

將42只CD大鼠隨機分為正常對照組(normal)、模型組、陽性對照組(復方七葉皂苷鈉凝膠)和化合物1、2、4和5組，共7組。每組6只，雌雄各半。正常組大鼠右后足趾皮下注入0.1 mL蒸餾水/只，其余6組均在大鼠右后足趾皮下注射1%交叉菜膠溶液(配置方法見文獻［3］)0.1 mL/只。致炎2 h后，陽性對照組和化合物1、2、4和5組每日定時腹腔注射給藥1次(劑量均為15 mg/kg)，連續給藥5 d。在致炎后第10 d，用排水法求出腫脹度，計算抑制率:抑制率(%)=(模型組平均腫脹度-給藥組平均腫脹度)/模型組平均腫脹度×100%。

2 結果

2.1 結構鑒定

化合物1 白色固體，mp.254～255℃，與三氯化鐵反應為陽性，提示含有酚羥基;ESI(+)-MS:(m/z)269［M+H］+，307［M+K］+;從元素分析得知碳、氫的含量分別為71.59%和4.51%;質譜結合元素分析提示該化合物的分子式為C16H12O4;IR(KBr)νmaxcm-1:3 133(-OH)，3 031(Ar-H 伸縮振動)，1 641(共軛 C=O)，1 604，1 572，1 503(苯環骨架伸縮振動)，2 978，2 843，1 383(-CH3)。1H NMR(DMSO-d6，500 MHz)δ:10.81(1H，brs，7-OH)為1個酚羥基質子信號;8.33(1H，s，H-2)為異黃酮2位質子的特征信號;7.93(1H，d，J=8.7 Hz，H-5)，6.95(1H，dd，J=8.7，2.4Hz，H-6)，6.85(1H，d，J=2.4 Hz，H-8)，7.47(2H，d，J=8.2 Hz，H-2'，6')，6.98(2H，d，J=8.2 Hz，H-3'，5')，3.76(3H，s，-OCH3)。13C NMR(DMSO-d6，125 MHz)δ:153.7(C-2)，123.3(C-3)，174.9(C-4)，127.2(C-5)，115.4(C-6)，162.9(C-7)，101.9(C-8)，159.3(C-9)，116.7(C-10)，124.0(C-1')，130.2(C-2'，6')，113.8(C-3'，5')，157.6(C-4')，55.6(-OCH3)。以上數據與文獻［4］報道的芒柄花素數據一致，故化合物1為芒柄花素。

化合物2 白色固體，mp.134～136℃。三氯化鐵反應陽性，示有酚羥基存在。ESI(+)-MS:(m/z)180 ［M+H］+，381［2M+Na］+;從元素分析得知碳、氫和氮的含量分別為67.01%、7.28%和7.79%;質譜結合元素分析提示該化合物的分子式為 C10H13NO2;IR(KBr)νmaxcm-1:3341～3229(-NH，-OH)，3029(Ar-H 伸縮振動)，1639(C=O)，1608，1527，1508(苯環骨架伸縮振動)，847(1，4-二取代苯的結構)。1H NMR(DMSO-d6，500 MHz)δ:9.21(1H，brs，4'-OH)，7.86(1H，brs，-NH)，7.01(2H，d，J=8.2 Hz，H-2'，6')，6.69(2H，d，J=8.2 Hz，H-3'，5')，3.17(2H，m，H-1)，2.56(2H，m，H-2)，1.85(3H，s，CH3CO-);13C NMR(DMSO-d6，125 MHz)δ:169.2(-C=O)，156.2(C-4')，130.1(C-1')，129.7(C-2'，6')，115.3(C-3'，5')，40.5(C-1)，34.0(C-2)，23.2(-CH3)。以上數據與文獻［5］報道的N-乙酰基-2-(4-羥苯基)乙胺數據一致，故化合物2為N-乙酰基-2-(4-羥苯基)乙胺。

化合物3 白色針晶(甲醇)，mp.172～173℃，IR(KBr)cm-1:3 429(-OH)，1 690(羧 C=O)，1 627，1 516，1 498(苯環骨架伸縮振動)。ESI(+)-MS顯示準分子離子峰m/z 195［M+H］;元素分析得碳、氫的百分含量分別為61.78、5.23;質譜和元素分析推出該化合物的分子式C10H10O4，相對分子質量為 194 。1H NMR(CDCl3，500 MHz)δ:3.82(3H，s，-OCH3)，6.37(1H，d，J=15.4 Hz，H-8)，6.75(d，J=8.2 Hz，H-5)，7.09(dd，J=8.2，2.0 Hz，H-6)，7.26(d，J=2.0 Hz，H-2)，7.51(d，J=15.4 Hz，H-7);13C NMR(CDCl3，125 MHz)δ:55.3(-OCH3)，112.2(C-2)，115.3(C-5)，115.9(C-6)，122.5(C-8)，125.6(C-1)，144.5(C-7)，147.6(C-4)，150.2(C-3)，167.8(C-9)。其理化數據與文獻對照基本一致［6］，故鑒定為阿魏酸。

化合物4 白色針晶(甲醇)，mp.113～115℃，三氯化鐵反應陽性，示有酚羥基存在。ESI(+)-MS:(m/z)153［M+H］+;從元素分析得知碳、氫的含量分別為70.98%和7.77%;質譜結合元素分析提示該化合物的分子式為C9H12O2;IR(KBr)νmaxcm-1:3 275(-OH)，3 039(Ar-H 伸縮振動)，1 601，1 522(苯環骨架伸縮振動)，1 309，1 046，865(1，2，3，4，5-五取代苯的結構);1H NMR(CDCl3，500 MHz)δ:8.83(1H，brs，1-OH)，7.94(1H，brs，2-OH)，6.29(1H，s，H-6)，2.03(3H，s，3-CH3)，2.08(3H，s，4-CH3)，2.14(3H，s，5-CH3);13C NMR(CDCl3，125 MHz)δ:154.3(C-1)，153.7(C-2)，135.6(C-3)，115.6(C-4)，110.2(C-5)，109.5(C-6)，9.7(3-CH3)，11.3(4-CH3)，19.8(5-CH3)。以上數據與文獻［7］報道的 5，7，4'-三羥基異黃酮數據一致，故化合物 4 為 3，4，5-三甲基-1，2-苯二酚。

化合物5 淺黃色針晶，m.p.250～252℃。三氯化鐵反應陽性，示有酚羥基存在。ESI(+)-MS:(m/z)285［M+H］+，307［M+Na］+;從元素分析得知碳、氫的含量分別為67.32%和3.98%;質譜結合元素分析提示該化合物的分子式為C16H12O5;IR(KBr)νmaxcm-1:3 221 ～3 396(-OH)，3 027(Ar-H 伸縮振動)，1 607，1 588，1 473(苯環骨架伸縮振動);1H NMR(CD3OD，500 MHz)δ:10.82(1H，brs，7-OH)，9.43(1H，brs，3'-OH)為 2 個酚羥基質子信號;6.67(1H，s，H-3)為黃酮3位質子的特征信號;7.86(1H，d，J=8.5 Hz，H-5)，6.90(1H，dd，J=8.5，2.0Hz，H-6)，6.95(1H，d，J=2.0 Hz，H-8)，7.40(1H，d，J=2.0 Hz，H-2')，7.03(1H，d，J=8.5 Hz，H-5')，7.55(1H，dd，J=8.5，2.0Hz，H-6')，3.85(3H，s，-OCH3).13C NMR(CD3OD，125 MHz)δ:162.4(C-2)，105.6(C-3)，176.4(C-4)，126.5(C-5)，115.2(C-6)，157.9(C-7)，102.3(C-8)，162.7(C-9)，116.0(C-10)，123.4(C-1')，113.1(C-2')，146.4(C-3')，159.7(C-4')，112.3(C-5')，117.8(C-6')，56.2(-OCH3)。以上數據與文獻［8-9］報道的7，3'-二羥基-4'-甲氧基黃酮數據一致，故化合物5為7，3'-二羥基-4'-甲氧基黃酮。

2.2 化合物1、2、4和5對交叉菜膠所致大鼠足趾腫脹的影響

實驗結果表明在給藥劑量相同的條件下，陽性對照組和化合物1、2、4和5對交叉菜膠所致大鼠足趾腫脹的抑制率分別為:48.8%，47.3%，16.8%，13.6%和50.4%。

3 討論

本實驗從一株耐酸鏈霉菌的發酵液中分離得到5個單體化合物，其中化合物1、4和5首次從放線菌中分離得到。抗炎實驗研究表明，化合物1和5具有較強的抗炎作用;化合物3雖未進行抗炎實驗研究，但是有文獻報道它具有較強抗炎作用［10］，因此本實驗初步研究結果為從本菌中尋找抗炎活性化合物打下了一定的基礎。

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