鏈霉菌YIM69228發酵液中化學成分的研究

周 皓，楊亞濱*，劉 運，彭天鳳，趙立興，徐麗華，丁中濤

1云南大學化學科學與工程學院;2云南大學云南省微生物研究所，昆明650091

鏈霉菌具有代謝途徑復雜，代謝產物種類繁多，產生的活性代謝產物多等特點，是產生在醫藥、農業、食品等領域具有重要意義的天然次生代謝產物的主要來源。近年來，對微生物代謝產物的研究日益增多，尤其是從鏈霉菌中尋找新藥先導化合物仍是目前相關研究的重要方向，許多具有生理活性或新穎結構的化合物從鏈霉菌中分離得到［1，2］。

鏈霉菌YIM69228是由云南省微生物研究所從云南省西雙版納豆腐渣果(Helicia nilagirica)中分離得到的一株鏈霉菌。通過抗菌活性篩選發現其對五種植物病原菌茄腐鐮刀菌，尖孢鐮刀菌，玉米小斑病菌，炭疽桿菌，絲核菌有一定的抗菌活性，我們對其發酵液進行了化學成分研究，共分離得到10個化合物，(S)-2-羥基-3-(4-甲氧基苯基)-丙酸(1)，異莨菪亭(2)，N-苯乙基乙酰胺(3)，肉桂酸(4)，丁二酸單甲酯(5)，3，4-二羥基苯甲酸(6)，海藻糖(7)，吐葉醇(8)，Citroside A(9)，芐基-β-D-吡喃木糖基-(1″-6')-β-D-吡喃葡萄糖苷(10)。首次鑒定了天然產物化合物1的構型，其中化合物8～10為首次從鏈霉菌屬放線菌中分離得到。

1 實驗部分

1．1 儀器和材料

Bruker DRX-500 MHz型核磁共振儀(TMS為內標);Agilent G3250AA spectrometer質譜儀;薄層色譜硅膠板和200～300目柱色譜硅膠(青島海洋化工廠);Sephadex LH-20(瑞典 GE HeaLthcare Bio-Sciences AB公司);Diaion HP20(日本三菱化學株式會社)。

1．2 菌種的培養

1．2．1 菌株

菌株YIM69228由云南大學云南省微生物研究所徐麗華研究員鑒定為鏈霉菌(Streptomycessp．)。菌株樣品保存于云南大學微生物研究所。

1．2．2 培養基

培養基:馬鈴薯 200 g，葡萄糖 20 g，CaCO30．2 g，MgSO40．2 g，定容至 1 L，pH 7。發酵培養條件:10%的接種量，500 mL三角瓶裝液量90 mL，200 rpm，28℃搖瓶培養6～7 d。

1．3 提取分離

菌株采用上述培養基發酵得發酵液40 L，用等體積的乙酸乙酯萃取3次，合并后得到發酵液乙酸乙酯提取浸膏10 g。經硅膠柱色譜分離，氯仿/甲醇(1∶0-0∶1)梯度洗脫，得到四個部分(Fr．l～4)。Fr．1經過反復硅膠柱色譜，石油醚/乙酸乙酯(20∶1-0∶1)洗脫得到化合物 2(4．2 mg)，3(2．8 mg)，4(5．3 mg)。Fr．2分別經Sephadex LH-20柱色譜(甲醇洗脫)及反復硅膠柱色譜，氯仿/甲醇(20∶1-5∶1)洗脫得到化合物1(1．5mg)，5(5．7mg)，6(2．5mg)。水相再經大孔樹脂(Diaion HP20)柱色譜，甲醇/水(0∶1-1∶0)洗脫，得到甲醇部分浸膏4 g。經Sephadex LH-20柱色譜(甲醇洗脫)及反復硅膠柱色譜，氯仿/甲醇(10∶1-2∶1)洗脫都得到化合物 7(65．7 mg)，8(5．3 mg)，9(4．2 mg)，10(5．4 mg)。

2 結果與討論

化合物 1 無色油狀，［α］25D:-19．3(c0．1，甲醇)。分子式為 C10H12O4。ESI-MSm/z:195［MH］-。1H NMR(CDCl3，500 MHz)δ:7.07(2H，d，J=8.1 Hz，H-5，9)，6.76(2H，d，J=8.1 Hz，H-6，8)，4.42(1H，dd，J=7.3，4.2Hz，H-2)，3.78(H，s，MeO)，3.05(1H，dd，J=14.3，4.2Hz，H-3a)，2.92(1H，dd，J=14.3，7.3Hz，H-3b);13C NMR(CDCl3，125 MHz)δ:175.0(C-1)，155.0(C-7)，131.1(C-5，C-9)，128.8(C-4)，115.7(C-6，C-8)，71.8(C-2)，52.8(MeO)，40.1(C-3)。與文獻報道的2-羥基-3-(4-甲氧基苯基)-丙酸的核磁數據［3］基本一致，但文獻中只報道了它的平面結構，通過旋光比對化合物1［α］25D:-19.3(c0.1，MeOH)與 Brenna 等［4］通過酶催化合成得到的(S)-2-羥基-3-(4-甲氧基苯基)-丙酸［α］25D:-9.6(c1.03，EtOH)基本一致，因此鑒定化合物1為(S)-2-羥基-3-(4-甲氧基苯基)-丙酸。

化合物2 白色粉末，分子式為C10H8O4。ESIMSm/z:193［M+H］+。1H NMR(CDCl3，500 MHz)δ:7.59(d，J=9.5 Hz，H-4)，6.92(s，H-8)，6.85(s，H-5)，6.27(d，J=9.5 Hz，H-3)，3.96(s，MeO);13C NMR(CDCl3，125 MHz)δ:161.7(C-2)，150.7(C-9)，150.1(C-6)，144.1(C-7)，143.6(C-4)，113.4(C-3)，111.9(C-10)，108.0(C-5)，103.6(C-8)，56.8(MeO)。以上數據與文獻報道的異莨菪亭數據基本一致［5］。

化合物3 白色粉末，分子式為 C10H13NO。ESI-MSm/z:164 ［M+H］+。1H NMR(CDCl3，500 MHz)δ:7.31-7.18(5H，m，H-Ar)，5.48(1H，brs，NH)，3.52(2H，m，H-8)，2.81(2H，m，H-7)，1.94(3H，s，Me);13C NMR(CDCl3，125 MHz)δ:170.0(CO)，138.9(C-1)，128.8(C-3，5)，128.7(C-2，6)，126.6(C-4)，40.7(C-8)，35.7(C-7)，23.3(Me)。以上數據與文獻報道［6］的N-苯乙基乙酰胺數據基本一致。

化合物4 白色粉末，分子式為C9H8O2。ESIMSm/z:149 ［M+H］+。1H NMR(CDCl3，500 MHz)δ:7.61(1H，d，J=16.2Hz，H-7)，7.43(2H，m，H-2，6)，7.33(3H，m，H-3，4，5)，6.41(1H，d，J=16.2 Hz，H-8);13C NMR(CDCl3，125 MHz)δ:176.8(C-9)，150.8(C-7)，137.6(C-1)，131.8(C-3，5)，131.3(C-2，6)，128.7(C-4)，119.9(C-8)。以上數據與文獻報道［7］基本一致，確定化合物4為肉桂酸。

化合物5 無色油狀，分子式為C5H8O4。ESIMSm/z:131 ［M-H］-。1H NMR(CDCl3，500 MHz)δ:3.73(3H，s，MeO)，2.65-2.72(4H，m，H-2，3);13C NMR(CDCl3，125 MHz)δ:177.7(C-4)，172.6(C-1)，51.9(MeO)，28.9(C-3)，28.6(C-2)。以上數據與文獻報道［8］基本一致，確定化合物5為丁二酸單甲酯。

化合物6 黃色粉末，分子式為C7H6O4。ESIMSm/z:153 ［M-H］-。1H NMR(MeOD，500 MHz)δ:7.25(1H，d，J=2.8Hz，H-2)，7.19(1H，dd，J=8.9，2.8 Hz，H-6)，6.71(1H，d，J=8.9 Hz，H-5);13C NMR(MeOD，125 MHz)δ:169.8(C-7)，151.8(C-4)，146.9(C-3)，122.1(C-6)，122.0(C-1)，117.6(C-2)，116.5(C-5)。以上數據與文獻報道［9］基本一致，確定化合物6為3，4-二羥基苯甲酸。

化合物7 無色柱狀結晶，分子式為C12H22O11。ESI-MSm/z:343［M+H］+。1H NMR(D2O，500 MHz)δ:5.88(1H，s)，4.78(1H，m)，4.59(1H，m)，4.35(1H，m)，4.24(1H，m)，4.08(2H，m);13C NMR(D2O，125 MHz)δ:94.9(d)，74.2(d)，73.9(d)，73.5(d)，71.9(d)，62.2(t)。以上數據與文獻報道［10］基本一致，確定化合物7為海藻糖。

化合物8 黃色針狀結晶，分子式為C13H20O3。ESI-MSm/z:225 ［M+H］+。1H NMR(CDCl3，500 MHz)δ:5.92(1H，m，H-4)，5.85(1H，m，H-7)，5.81(1H，m，H-8)，4.42(1H，m，H-9)，2.46(1H，d，J=17.1 Hz，H-2a)，2.25(1H，d，J=17.1Hz，H-2b)，1.91(3H，s，H-11)，1.31(3H，d，J=6.3Hz，H-10)，1.10(3H，s，H-12)，1.03(3H，s，H-13);13C NMR(CDCl3，125 MHz)δ:199.2(C-3)，163.9(C-5)，136.8(C-8)，130.1(C-7)，128.0(C-4)，80.2(C-6)，69.2(C-9)，50.8(C-2)，42.3(C-1)，25.2(C-13)，24.8(C-10)，24.0(C-12)，20.0(C-11)。以上數據與文獻報道［11］基本一致，確定化合物8為吐葉醇。

化合物9 白色針狀結晶，分子式為C19H30O8。ESI-MSm/z:409 ［M+Na］+。1H NMR(MeOD，500 MHz)δ:5.92(1H，s，H-8)，4.54(1H，d，J=7.8 Hz，H-1')，4.35(1H，m，H-3)，3.83(1H，d，J=11.5 Hz，H-6'a)，3.63(1H，dd，J=11.5，5.3 Hz H-6'b)，3.16-3.37(4H，m，H-2'-5')，2.51(1H，d，J=12.4Hz，H-4a)，2.22(3H，s，H-10)，1.94(1H，d，J=11.5 Hz，H-2a)，1.49(3H，s，H-13)，1.40(3H，s，H-12)，1.33(2H，m，H-2b，4b)，1.18(3H，s，H-11);13C NMR(MeOD，125 MHz)δ:213.4(C-9)，201.1(C-7)，119.5(C-6)，101.8(C-8)，99.1(C-1')，79.2(C-5)，79.0(C-3')，78.2(C-5')，75.7(C-2')，72.2(C-4')，64.2(C-3)，63.3(C-6')，50.3(C-2)，48.5(C-4)，37.5(C-1)，32.9(C-11)，30.5(C-12)，27.1(C-13)，27.0(C-10)。以上數據與文獻報道［12］基本一致，并通過二維NMR歸屬了碳氫譜，確定化合物9為Citroside A。

化合物10 黃色針狀結晶，分子式為C18H26O10。ESI-MSm/z:401 ［M-H］-。1H NMR(MeOD，500 MHz)δ:7.28 ～7.45(5H，m，H-Ar)，4.93(1H，d，J=11.5 Hz，H-7a)，4.68(1H，d，J=11.5 Hz，H-7b)，4.38(1H，d，J=7.8Hz，H-1')，4.36(1H，d，J=6.9 Hz，H-1″);13C NMR(MeOD，125 MHz)δ:139.5，129.6，129.5，129.1(C-Ar)，105.6(C-1″)，103.8(C-1')，78.4(C-3')，77.9(C-5')，76.5(C-3″)，74.6(C-2″)，74.4(C-2')，72.4(C-7)，72.2(C-4″)，71.1(C-4')，69.9(C-6')，67.1(C-5″)。以上數據與文獻報道［13］基本一致，確定化合物10為芐基-β-D-吡喃木糖基-(1″-6')-β-D-吡喃葡萄糖苷。

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