苦蕎提取物磷脂復(fù)合物的制備工藝研究

鄒 亮，馬育彪，傅秀娟，許麗佳，彭鐮心，趙江林，趙 鋼*

1成都大學(xué)生物產(chǎn)業(yè)學(xué)院，成都610106;2瀘州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，瀘州646000

苦蕎為蓼科蕎麥屬植物苦蕎麥Fagopyrum tataricum(L．)Gaertn．的干燥成熟種子，又名韃靼蕎、萬(wàn)年蕎、野南蕎［1］，是我國(guó)的一種特色小雜糧作物。苦蕎中富含蘆丁、槲皮素、山萘酚等黃酮類(lèi)化合物［2，3］，現(xiàn)代研究表明，苦蕎具有降糖降脂、抗氧化、抗衰老及治療心腦、血管系統(tǒng)疾病等多種功效作用［3-5］。

普通黃酮類(lèi)成分的油水分配系數(shù)較小，人體吸收較差。而據(jù)許多研究報(bào)道，將天然活性成分與磷脂在一定條件下進(jìn)行復(fù)合，可制得活性成分的磷脂復(fù)合物(phospholipid complex)。復(fù)合物的理化性質(zhì)較原物質(zhì)發(fā)生較大的改變，親脂性增強(qiáng);并由于磷脂是細(xì)胞膜的基本組成部分，與細(xì)胞膜的親和力較強(qiáng)，從而能夠使磷脂復(fù)合物的生物性質(zhì)發(fā)生明顯的改善，生物利用度大大提高［6，7］。

為更好的開(kāi)發(fā)利用苦蕎這一藥食同源的植物資源，本研究設(shè)計(jì)將苦蕎提取物與大豆磷脂制備成磷脂復(fù)合物，以有效提高蘆丁等黃酮類(lèi)物質(zhì)的生物利用度，增強(qiáng)其功效作用。

1 試藥與儀器

1．1 試藥

苦蕎提取物(成都大學(xué)生物產(chǎn)業(yè)學(xué)院自制，含蘆丁19．2%，槲皮素5．1%);大豆卵磷脂購(gòu)自上海棋陽(yáng)進(jìn)出口有限公司(S75);槲皮素對(duì)照品(批號(hào):100081-200907)、蘆丁對(duì)照品(批號(hào):100080-200707)均購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所;無(wú)水乙醇、四氫呋喃、二氯甲烷、甲酸、正辛醇、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、氫氧化鈉等均為分析純，甲醇為色譜純，水為超純水。

1．2 儀器

LC-20A高效液相色譜儀:LC-20AB泵，SPDM20A檢測(cè)器，LC-solutions工作站(日本島津公司);RE-52B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠);B5-2型恒溫磁力加熱攪拌器(上海司樂(lè)儀器有限公司);數(shù)顯恒溫水浴鍋HH-S(金壇市醫(yī)療儀器廠);BT403S、TB-214電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器公司);KQ-100DE超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)。

2 試驗(yàn)方法與結(jié)果

2．1 苦蕎總黃酮含量測(cè)定

色譜柱:Kromasil C18柱(4．6 mm × 150 mm，5 μm);流速:1．0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng):280 nm;柱溫:30℃;流動(dòng)相:甲醇-0．2%甲酸溶液(50∶50);進(jìn)樣量:10 μL。

2．1．2 樣品的測(cè)定

對(duì)照品溶液的制備:分別精密稱(chēng)取蘆丁和槲皮素對(duì)照品適量，甲醇溶解稀釋制成每1 mL含蘆丁0．048 mg，含槲皮素0．012 mg的混合對(duì)照品溶液。

供試品溶液的制備:精密稱(chēng)取制備好的磷脂復(fù)合物約40 mg，置于50 mL量瓶中，加甲醇適量，超聲30 min，取出，冷卻至室溫，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

取上述對(duì)照品溶液和供試品溶液10μL，按照擬定的色譜條件檢測(cè)。

2．2 制備工藝評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)的建立

利用苦蕎提取物不溶于二氯甲烷，而磷脂與苦蕎提取物磷脂復(fù)合物均易溶于二氯甲烷的特性，將一定量的苦蕎提取物與磷脂在一定條件下反應(yīng)后，減壓除去反應(yīng)溶劑，然后再加入適量二氯甲烷，充分溶解其中的磷脂及復(fù)合物，過(guò)濾，收集濾液。將二氯甲烷于水浴蒸干，收集固體，測(cè)定總黃酮的復(fù)合率。

總黃酮含量=蘆丁含量+槲皮素含量

《商品學(xué)》教學(xué)質(zhì)量評(píng)估多以試卷的形式，考察的內(nèi)容以理論知識(shí)為主，不能有效的了解到學(xué)生是否能學(xué)以致用、舉一反三，目的性太差。《商品學(xué)》課程中實(shí)行實(shí)踐教學(xué)后，實(shí)踐教學(xué)成果的相關(guān)信息如何反饋、實(shí)踐教學(xué)的質(zhì)量如何評(píng)估也是一個(gè)待解決的難題。

按下式計(jì)算黃酮復(fù)合率:

2．3 單因素影響試驗(yàn)

2．3．1 反應(yīng)溶劑

當(dāng)苦蕎提取物與磷脂的質(zhì)量比為1∶2，苦蕎提取物的濃度為1mg/mL時(shí)，在室溫下反應(yīng)8 h的條件下，分別以無(wú)水乙醇、四氫呋喃、二氯甲烷-甲醇(6∶1)作為反應(yīng)溶劑，進(jìn)行溶劑的選擇。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 溶劑對(duì)復(fù)合率的影響(n=2)Table 1 The effect of solvent on the complexing rate(n=2)

結(jié)果顯示，以四氫呋喃和無(wú)水乙醇為溶劑時(shí)，苦蕎總黃酮與磷脂的復(fù)合率較高，考慮到試驗(yàn)中四氫呋喃制得的樣品呈液態(tài)狀，比較難以干燥，在一定程度上影響了結(jié)果的準(zhǔn)確性，且四氫呋喃毒性比較大、價(jià)格貴，故選用無(wú)水乙醇作為反應(yīng)溶劑。

2．3．2 提取物濃度的影響

以無(wú)水乙醇作為反應(yīng)溶劑，提取物與磷脂的質(zhì)量比為1∶2，室溫，反應(yīng)時(shí)間8 h，考察提取物的反應(yīng)濃度分別為0．5、1．0、2．0 mg/mL 時(shí)的復(fù)合率。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 提取物濃度對(duì)復(fù)合率的影響(n=2)Table 2 The effect of extractions concentration on the recombination rate(n=2)

結(jié)果顯示，提取物反應(yīng)濃度較高時(shí)，復(fù)合率較高，但是當(dāng)反應(yīng)濃度為2 mg/mL時(shí)，將反應(yīng)產(chǎn)物用二氯甲烷溶解過(guò)濾時(shí)，過(guò)濾較為困難，考慮到實(shí)際生產(chǎn)中縮短生產(chǎn)時(shí)間，節(jié)約生產(chǎn)成本，且2 mg/mL與1 mg/mL的復(fù)合率差異較小，因此選用1 mg/mL的提取物濃度進(jìn)行反應(yīng)。

2．3．3 苦蕎提取物與磷脂的質(zhì)量比

以無(wú)水乙醇作為反應(yīng)溶劑，苦蕎提取物的濃度為1 mg/mL，室溫，反應(yīng)時(shí)間8 h，分別對(duì)苦蕎提取物與磷脂反應(yīng)的質(zhì)量比1∶1、1∶2、1∶3 的復(fù)合率進(jìn)行考察。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 提取物與磷脂比對(duì)復(fù)合率的影響(n=2)Table 3 The effectofmass ratio of the extracts and phopholipid on the complexing rate(n=2)

結(jié)果表明，隨著苦蕎提取物與磷脂的反應(yīng)質(zhì)量比例越高，復(fù)合率越高，但是試驗(yàn)顯示，當(dāng)二者的比例為1∶3時(shí)，反應(yīng)得到的產(chǎn)物難以完全干燥，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果有所影響，且增加生產(chǎn)難度和生產(chǎn)成本。因此，選定苦蕎提取物與磷脂的反應(yīng)質(zhì)量比為1∶2。

2．3．4 反應(yīng)溫度的影響

以無(wú)水乙醇作為反應(yīng)溶劑，提取物的濃度為1mg/mL，提取物與磷脂的質(zhì)量比為1∶2，反應(yīng)時(shí)間8 h，分別在反應(yīng)溫度為室溫、40、50℃時(shí)進(jìn)行考察。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 溫度對(duì)復(fù)合率的影響(n=2)Table 4 The effect of reaction temperature on the complexing rate(n=2)

結(jié)果顯示，反應(yīng)溫度為40℃和50℃時(shí)，其復(fù)合率明顯較室溫有所提高，且由于磷脂在高溫情況下穩(wěn)定性較差。因此選擇反應(yīng)溫度為40℃。

2．3．5 反應(yīng)時(shí)間的影響

以無(wú)水乙醇作為反應(yīng)溶劑，提取物的濃度為1mg/mL，提取物與磷脂的質(zhì)量比為1∶2，反應(yīng)溫度為40℃，對(duì)反應(yīng)時(shí)間分別為8、16、24、36 h進(jìn)行考察，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 反應(yīng)時(shí)間對(duì)復(fù)合率的影響(n=2)Table 5 The effect of reaction time on the complexing rate(n=2)

試驗(yàn)結(jié)果顯示，苦蕎提取物與磷脂在24 h時(shí)，反應(yīng)復(fù)合率較高，與36 h差異不大，因此初步將反應(yīng)時(shí)間定為24 h。

2．4 制備工藝的確定與驗(yàn)證

根據(jù)上述單因素試驗(yàn)的考察結(jié)果，確定苦蕎提取物磷脂復(fù)合物的優(yōu)化工藝為:反應(yīng)溶劑為無(wú)水乙醇，提取物的濃度為1mg/mL，提取物與磷脂的質(zhì)量比為1∶2，反應(yīng)溫度為40℃，反應(yīng)時(shí)間24 h。按照優(yōu)化工藝制備3批苦蕎提取物磷脂復(fù)合物，結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 工藝驗(yàn)證結(jié)果Table 6 Validation results of the preparation condition

以上結(jié)果表明，所確定的苦蕎磷脂復(fù)合物制備工藝穩(wěn)定，復(fù)合率較高，適合用于制備苦蕎提取物磷脂復(fù)合物。

2．5 苦蕎提取物磷脂復(fù)合物表觀油水分配系數(shù)的測(cè)定

稱(chēng)取苦蕎提取物與苦蕎提取物磷脂復(fù)合物適量，分別用正辛醇溶解，離心后待用。精密移取10 mL各樣品的正辛醇溶液及不同pH的水溶液，置于50mL的錐形瓶中，用磁力攪拌器攪拌8 h后，靜置，取上層正辛醇溶液轉(zhuǎn)移至離心管中，3000 rpm離心10 min。移取上清液5mL，按2．1．2項(xiàng)下的樣品測(cè)定方法處理，按上述色譜條件檢測(cè)，計(jì)算總黃酮的含量。結(jié)果見(jiàn)表7。

表7 苦蕎提取物及復(fù)合物中總黃酮表觀油水分配系數(shù)測(cè)定結(jié)果Table 7 Results of partition coefficient of total flavone in tartary buckwheat extracts and its phospholipid complex

結(jié)果表明，制成磷脂復(fù)合物以后，總黃酮在正辛醇 和不同pH值的水溶液中表觀油水分配系數(shù)提高了約1．5～2．5倍，說(shuō)明制成磷脂復(fù)合物以后總黃酮的脂溶性有了明顯的提高。

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)以無(wú)水乙醇作為反應(yīng)溶劑，采用攪拌法制備了苦蕎提取物磷脂復(fù)合物，得出制備復(fù)合物的最佳工藝為提取物的濃度為1 mg/mL，提取物與磷脂的質(zhì)量比為1∶2，反應(yīng)溫度40℃，反應(yīng)時(shí)間24 h，復(fù)合率能夠達(dá)到80%以上。同時(shí)分別測(cè)定了苦蕎提取物與苦蕎提取物磷脂復(fù)合物在不同pH溶液中總黃酮的表觀油水分配系數(shù)，結(jié)果表明，形成復(fù)合物后確實(shí)提高了苦蕎提取物中黃酮類(lèi)成分的脂溶性，與文獻(xiàn)［9，10］報(bào)道的天然活性成分形成磷脂復(fù)合物后可增強(qiáng)親脂性的結(jié)論相符。

試驗(yàn)結(jié)果顯示，苦蕎提取物的復(fù)合率在80%以上，同時(shí)工藝驗(yàn)證結(jié)果證明該復(fù)合條件重復(fù)性較好。但與文獻(xiàn)報(bào)道其他藥物(如靛玉紅［9］、吳茱萸堿［10］等)的復(fù)合率往往能達(dá)到90%以上相比要低一些，經(jīng)初步分析，可能是由于苦蕎提取物中的其他成分減弱了蘆丁、槲皮素等黃酮化合物和磷脂的分子鍵合，以致苦蕎提取物的復(fù)合率未能有進(jìn)一步的提高。

1 Sun BH(孫博航)，Wu YQ(吳雅清)，Gao HY(高慧嬡)，et al．Chemical constituents ofFagopyrum tataricum(L．)Gaertn．J Shenyang Pharm Univ(沈陽(yáng)藥科大學(xué)學(xué)報(bào))，2008，25:541-543．

2 Bi YP(畢研平)，Su YF(蘇艷芳)，Cai X(柴欣)，et al．Advances in studies on chemical constituents and bioactivities for plants of buckwheat．Northwest Pharm J(西北藥學(xué)雜志)，2008，23:116-118．

3 Zhang R(張瑞)，Wang YP(王英平)，Ren GX(任貴興)．Research status of tartary buckwheat．SpecWild Econ Animal Plant Res(特產(chǎn)研究)，2008，1:74-77．

4 Li J(李潔)，Liang YQ(梁月琴)，Hao YB(郝一彬)．Lowering blood lipid effect of flavonoids of tatary buckwheat．J Shanxi Med Univ(山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào))，2004，35:570-571．

5 Liu CL，Chen YS，Yang JH，et al．Antioxidant activity of tartary(Fagopyrum tataricumL．Gaertn．)and common buckwheat．J Agric Food Chem，2008，56:173-178．

6 Qu GX(翟光喜)，Lou HX(婁紅祥)，Zou LJ(鄒立家)，et al．Progress on studiesof drug-phospholipid complexes．Chin Pharm J(中國(guó)藥學(xué)雜志)，2001，36:800-803．

7 Sun J(孫俊)，Chen ZP(陳志鵬)，Cai BC(蔡寶昌)．Preparation of Ginkgo Biloba extract phospholipid complex．Chin Arch Tradit Chin Med(中華中醫(yī)藥學(xué)刊)，2009，27:2671-2673．

8 Zou L(鄒亮)，Wang ZG(王戰(zhàn)國(guó))，Hu HL(胡慧玲)，et al．Determination of rutin and quercetin in tartary buckwheat extract．Chin JExp Tradit Med Formul(中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志)，2010，16(17):60-62．

9 Zhou J(周靜)，Wu ZH(吳正紅)，Ping QN(平其能)，et al．Preparation and physicochemical properties of indirubin-phospholipid complex．Chin J Pharm(中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)雜志)，2006，37:394-397．

10 Liu S(柳珊)，Tan QY(譚群友)，Wang H(王紅)，et al．Preparation，characterization andin vitroanti-tumor activities of evodiamine phospholipids complex．Chin Pharm J(中國(guó)藥學(xué)雜志)，2012，47:517．