大孔吸附樹脂對金銀花葉莖藤總黃酮的吸附性能

陳莉華，肖 斌，賀誠志，朱 健

吉首大學化學化工學院，吉首416000

金銀花為忍冬科多年生半常綠纏繞植物，又名忍冬花、銀花、雙花等［1］，在醫院臨床和中成藥生產中應用廣泛。研究表明，金銀花葉莖藤和金銀花在臨床上均有清熱解毒之功效，尤其是葉的有效成分和藥理作用不亞于花［2-4］，但藥源遠比金銀花豐富，且采集容易，價格便宜。金銀花葉莖藤中除含有綠原酸外，還含有黃酮類化合物［3-6］，研究金銀花葉莖藤中的黃酮的提取及純化工藝，可為金銀花藥材資源的充分利用提供一定的參考和依據。

大孔樹脂吸附分離技術可顯著提高有效成分的相對含量，具有價廉、吸附容量大，周期短、可重復使用等優點，在天然產物有效成分的精制純化中已被廣泛應用［2，3，5-7］。本文采用超聲波法從金銀花葉莖藤中提取黃酮類化合物，用最常見的D101大孔吸附樹脂純化提取物，以黃酮的單位吸附量、吸附率和解吸附率為評價指標，對金銀花葉莖藤總黃酮在樹脂上的動態吸附和解吸工藝條件進行了優化，并深入探討了吸附機理，為深入利用金銀花資源提供實驗依據。

1 實驗部分

1．1 儀器和材料

UV-2450紫外可見分光光度計(日本島津);KQ-250E超聲波發生器(昆山市超聲儀器有限公司);R-201B-II旋轉蒸發儀(鄭州長城科工貿有限公司);pHS-25酸度計(上海日島科學儀器有限公司);DZF-6020真空干燥箱(上海精宏實驗設備有限公司);HH-S恒溫水浴鍋(鄭州長城科工貿有限公司);層析柱(直徑∶長度1∶8);粉粹機。蘆丁標準品(比利時進口，北京化學試劑有限公司);無水乙醇、石油醚、D-101 大孔樹脂、NaNO2、Al(NO3)3、NaOH、HCl(以上試劑均為分析純)。

1．2 實驗方法

1．2．1 D-101大孔吸附樹脂的預處理

稱取80 g D-101大孔吸附樹脂加入3 BV無水乙醇充分浸泡24 h，蒸餾水洗至無醇味;然后加入2 BV 5%稀鹽酸浸泡12 h，蒸餾水沖洗樹脂至流出液pH值為中性;最后加入2 BV 5%氫氧化鈉溶液浸泡12 h，蒸餾水沖洗樹脂至流出液pH值為中性。

1．2．2 金銀花葉莖藤總黃酮的提取

稱取一定量的金銀花葉莖藤碎屑，加入60%的乙醇，置于超聲波發生器中，在溫度50℃下超聲30 min，重復2次，合并提取液，減壓旋蒸回收乙醇，濃縮液用3∶1的石油醚脫色至石油醚層基本無色，將下層濃縮液用1∶3(濃縮液體積∶乙醇體積)80%的乙醇浸泡并靜置16 h，最后將上層清液減壓回收乙醇后得到黃酮提取液。

1．2．3 樣品中黃酮含量的測定

以蘆丁為黃酮對照品按NaNO2-Al(NO3)3-NaOH法繪制標準曲線并用于測定粗提液和純化液中黃酮含量。用紫外可見分光光度計測波長在510 nm處的吸光值A，以濃度(c)對吸光值A進行線性回歸，得回歸方程為:c=0．0939A(R2=0．9998)。濃度在0～0．05 mg/mL之間具有良好的線性關系。取黃酮樣品溶液(粗提液或純化液)1．0 mL，置于25 mL容量瓶中，按照繪制蘆丁標準曲線的方法測定吸光值，計算黃酮提取率及黃酮純度。

1．2．4 各種試驗條件對吸附效果的影響

精確稱取經預處理好的D-101大孔吸附樹脂2．0 g，裝入具塞錐形瓶中，依次改變實驗條件，考察樣品液濃度、料液比、樣品液pH值、不同靜置時間等因素對吸附效果的影響。

1．2．5 D-101大孔樹脂靜態吸附動力學實驗

稱取預處理好的D-101大孔吸附樹脂2．0 g，加入50 mL黃酮濃度為0．538 mg/mL的樣品溶液，常溫振蕩吸附24 h，前120 min每隔15 min取樣，120 min后，每隔60 min取樣測一次吸光度。計算吸附平衡后溶液中總黃酮的濃度［8］。

1．2．6 吸附等溫線及吸附熱力學

分別在溫度 30、40、50、60、70 ℃ 下用 D-101 大孔樹脂吸附至飽和，測定吸附平衡時黃酮的濃度，計算其單位吸附量及平衡濃度，得到不同溫度下的吸附等溫線［6，9］。

1．2．7 不同體積分數的乙醇洗脫液對大孔樹脂解吸率的影響

精密稱取預處理好的D-101大孔樹脂2．0 g，濕法裝柱，加入一定量的樣品溶液，吸附完全后，分別加入35、45、55、75、85 和 95% 乙醇溶液 30 mL 進行洗脫，控制流速為2 mL/min，收集洗脫液并測定洗脫液中黃酮的含量，計算解吸率，考察乙醇洗脫液對大孔樹脂解吸附率的影響。

1．2．8 動態洗脫曲線

在動態吸附實驗確定的工藝條件下，使金銀花黃酮水溶液通過D-101大孔樹脂柱，直至吸附飽和，然后用75%的乙醇溶液以2 mL/min的流速進行動態洗脫，洗脫液分段收集，每5 mL收集1份，并測定每份溶液中總黃酮的濃度，繪制洗脫曲線。

2 結果與討論

2．1 影響吸附效果的各種因素

2．2．1 樣品液濃度對吸附效果的影響

圖1 樣品液濃度對樹脂吸附率的影響Fig.1 Effect of sample solution concentration on adsorption rate

由圖1可知樣品液濃度是大孔樹脂吸附過程中的一個重要影響因素。在實驗濃度范圍內樹脂對黃酮的吸附率隨著樣品液濃度的增加而減小，D-101大孔樹脂對金銀花葉莖藤黃酮吸附的最佳濃度為0．5380 mg/mL，引起此現象可能原因為:隨著樣品液濃度的提高，總黃酮分子在樹脂內部擴散能力可能降低，并且濃度增加后，與總黃酮競爭大孔樹脂吸附位點的雜質量也會增加，因而樹脂的目標吸附率反而會下降。

2．1．2 料液比對吸附效果的影響

用料液比代表所用大孔樹脂質量(g)吸附總黃酮溶液體積(mL)，實驗結果表明，當料液比為1∶5時大孔樹脂吸附率為79．06%，當料液比為1∶2時，吸附率維持不變，但浪費樹脂;當樹脂用量不變而增大黃酮溶液體積時，吸附率幾乎成線性下降，表明樹脂用量太少，吸附無法達到飽和。所以1∶5的料液比為最佳選擇。

2．1．3 樣品液pH值對吸附效果的影響

圖2 pH對吸附效果的影響Fig.2 Effect of pH on adsorption rate

從圖2可以看出，pH值較小時，大孔樹脂對黃酮的吸附率較低，當pH為2時，樹脂的吸附率達到最大值，隨著pH值的升高，大孔樹脂對黃酮的吸附率逐漸降低，選擇最佳pH值為2。

2．1．4 靜置時間對吸附率的影響

實驗結果表明隨著靜置時間的增大樣品吸附率升高，靜置時間到80 min時的吸附率達到最大，為97．4%，靜置時間繼續增加，吸附率反而減小。

2．2 吸附動力學

2．2．1D-101大孔樹脂的靜態吸附動力學特性

吸附過程的動力學主要研究吸附過程的速率，吸附速率控制固-液界面上吸附質的滯留時間。按照實驗方法得到吸附量隨時間變化的動力學曲線，結果見圖3。

圖3 樹脂靜態吸附動力學曲線Fig.3 Static adsorption curve

如圖3可知，D-101大孔樹脂對金銀花葉莖藤中總黃酮的吸附為快速平衡型，開始單位吸附量變化較大，100 min以后單位吸附量隨時間增大緩慢，210min以后吸附量基本不再變化，表明在實驗條件下吸附達到了平衡。平衡時吸附量為8．06 mg/g。

圖4 準二級吸附動力曲線Fig.4 Pseudo-second adsorption kinetic curve

2．2．2 吸附速率常數

將圖4中實驗數據用Pseudo-second-order模型進行處理［11］，其線性方程表示如下:式中:K為表觀吸附速率常數，q和q分別為反te應時間t和平衡時樹脂的吸附量，以對t做圖得圖3，求得直線方程及對應的相關系數為為:y=0.1198x+1．4926，r=0．9999，結果表明 D-101 大孔樹脂對金銀花葉莖藤浸出液中黃酮的吸附動力學可用Pseudo-second-order模型描述，由擬合線性方程式可得表觀吸附速率常數K25℃=1．034×10-2g/mg·min。

2．3 吸附熱力學

2．3．1 吸附等溫線

為了研究吸附劑與被吸附物質之間的相互作用以及各類參數對吸附狀態的影響，本文采用最常見的 Langmuir 等溫吸附方程［9，10］對吸附等溫線數據進行擬合，以描述其吸附機制。配制系列不同濃度的金銀花葉莖藤浸出液，不同溫度下用D-101大孔樹脂吸附至飽和，測定吸附平衡時黃酮的濃度，計算其單位吸附量及平衡濃度，得到不同溫度下的吸附等溫線，結果見圖5。

圖5 不同溫度下的吸附等溫線Fig.5 Adsorption isotherms at different temperature

圖5表明隨著溶液中黃酮濃度的升高，D-101樹脂的單位吸附量增加，將圖5中實驗數據用Langmuir模型進行處理，其線性方程表示如下:

式中:Ce(mg/L)為溶液平衡濃度;qe(mg/g)為單位吸附量;Qm(mg/g)為飽和單位吸附量;a為Langmuir方程常數。以Ce/qe為縱坐標，Ce為橫坐標，繪制不同溫度下線性擬合等溫吸附曲線，其參數見表1。

表1 朗格繆爾等溫線常數和相關系數Table 1 Langmuir isotherm constants and correlation coefficients

由相關系數可知，用D-101樹脂對金銀花葉莖藤中的黃酮進行吸附時，其吸附模型可用Langmuir模型描述。從表中還可以看出，對于一定量的樹脂，本實驗采用35℃進行吸附效果最好，隨著溫度的升高，飽和單位吸附量下降，原因可能是樹脂吸附金銀花葉莖藤中的黃酮的過程是自發放熱的過程，溫度較高時，黃酮的溶解性增加，不利于黃酮分子與樹脂表面活性位點的結合，從而導致樹脂對其的吸附力降低。

2．3．2 D-101大孔樹脂吸附黃酮的焓變ΔH

D-101大孔樹脂吸附黃酮的焓變在吸附量一定時，吸附焓 ΔH可由 Vant Hoff方程［11］計算，Vant Hoff方程經整理得下式:lg(1/Ce)=lgK+(-ΔH/RT);式中 R 為氣體常數(8．314 J/mol·K)，Ce為黃酮的吸附平衡濃度，K為常數。以lg(1/Ce)對1/T作圖，由直線的斜率計算ΔH，計算結果見表2。

表2 焓變ΔH隨吸附量的變化Table 2 The change ofΔH with adsorption capacity

由表2知，黃酮在D-101大孔樹脂上的吸附焓變為負值，且絕對值均小于20 kJ/mol，表明吸附為放熱的物理吸附過程，低的ΔH值說明該樹脂容易脫附再生。此外，吸附焓變隨著吸附量的增大而減小，這主要是由于D-101樹脂表面的不均勻性所致:在吸附開始時，吸附質會被吸附在樹脂表面上吸附中心最活潑的地方，此時吸附活化能最小，放出的吸附熱最大，隨著吸附量的增加，樹脂內部最活潑的活性中心逐步被占據，吸附質只能吸附在那些較不活潑的吸附中心上，此時吸附活化能增加，使得吸附熱有所減小。

2．4 不同體積分數的乙醇洗脫液對大孔樹脂解吸率的影響

實驗結果表明，隨乙醇體積分數的增大，總黃酮解吸率逐漸增加，至乙醇體積分數為75%時，總黃酮解吸率達到最大，為94．5%;乙醇體積分數繼續增大洗脫率反而減小?？梢娨掖俭w積分數過低或過高都不利于樣品解吸。

2．5 動態解吸曲線

從圖6可以看出，采用75%的乙醇溶液以2 mL/min的流速進行動態洗脫，洗脫峰集中，沒有明顯的拖尾現象。用60 mL的75%乙醇就可以將提取物黃酮基本洗脫下來，此時黃酮收率達94．5%。純化后黃酮純度為84．5%，是粗提液黃酮含量(16．8%)的5倍，說明D-101大孔吸附樹脂能有效地富集純化金銀花葉莖藤浸出液中的總黃酮。

圖6 D-101樹脂解吸曲線Fig.6 Desorption curve

3 結論

用D-101大孔吸附樹脂可有效分離純化金銀花葉莖藤總黃酮，溫度30℃最佳吸附工藝參數為:黃酮樣液濃度0．538 mg/mL、靜置吸附時間80 min、料液比5∶1、pH 2。最佳解吸附工藝參數為:流速為2 mL/min下用60 mL 75%的乙醇溶液洗脫黃酮回收率高達94．5%。金銀花葉莖藤粗提液總黃酮得率為1．1%，在最佳吸附及解吸工藝條件下，黃酮純度由純化前的16．8%提高至84．5%，純度提高5倍。

D-101大孔樹脂對金銀花葉莖藤總黃酮的吸附方式是單分子層吸附，很好地符合Langmuir吸附等溫方程式，是自發性放熱過程。

D-101樹脂吸附金銀花葉莖藤中黃酮的吸附動力學可用Pseudo-second-order模型較好地擬合，其表觀吸附速率常數為K30℃=1．034×10-2g/mg·min。藥典)．Beijing:Chemical Industry Press，2005．152-153．

2 Yang JX(楊軍宣)，Yin RL(尹蓉麗)，Chen JY(陳金玉)，et al．Study on purification of chlorogenic acid from Lonicera Japonica leaves with macroporous resin．Chin J Exp Tradit Med Form(中國實驗方劑學雜志)，2010，16(15):20-23．

3 Luo Y(羅悠)，Chen LH(陳莉華)，Liang X(梁玄)，et al．Simultaneous extraction and isolation of chlorogenic acid and flavonoids from leaves and rattan of Lonicera Japonica．J Jishou Univ，Nat Sci(吉首大學學報，自科版)，2011，32(5):91-94．

4 Li JY(李錦宇)，Chen LH(陳莉華)，Luo Y(羅悠)．The extractingmethod of effective component from leaves and rattan ofLonicera japonicab(一種從金銀花葉莖藤中提取有效成分的方法):China(中國)，201110291030．9:2012-1-25．

5 Wang LT(王麗婷)，Wang LJ(王麗娟)．The separation and purification procedures of total flavonoids in Honeysuckle Leaves．West China J Pharm Sci(華西藥學雜志)，2010，25:575-576．

6 Hu ZJ(胡志軍)，Shen LL(沈玲玲)，Wan NX(王南溪)，et al．Study of separation and purification flavonoids from Lonicera Japonica Thund by macroporous adsorption resin．Ion Exch Adsorp(離子交換與吸附)，2011，27:229-237．

7 You H(游輝)，Sun AD(孫愛東)，Tang L(唐玲)，et al．Macroporous resin adsorption for purification of crude flavonoids from bamboo leaves．Food Sci(食品科學)，2010，31(8):24-27．

8 Mo XY(莫曉燕)，Xu J(徐靜)，ShaoWX(邵衛祥)．Purification of flavonoids from mesosperms of Ginkgo biloba with macro porous adsorbing resins．Nat Prod Res Dev(天然產物研究與開發)，2008，20:157-160．

9 Sun L(孫磊)，Wang YR(王玉蓉)，LiWF(李維峰)．Adsorptive thermodynamics and dynamics ofmacroporous resin for total saponin in Radix Polygalae．JBeijing Univ of Tradit Chin Med(北京中醫藥大學學報)，2006，29:772-775．

10 Chen HQ(陳寒青)，Jin ZY(金征宇)．Study on separation of Trifolium pratense isoflavones by macroporous resins．Nat Prod Res Dev(天然產物研究與開發)，2006，18:187-192．

11 Wua FC，Tseng RL，Huang HC，etal．Characteristics of pseudo-second-order kinetic model for liquid-phaseadsorption:A mini-review．Chem Eng J，2009，151(1-3):1-9．