樹突狀細胞誘導小腸移植免疫耐受的研究進展

楊 洋 綜述，沈中陽，宋紅麗 審校

（天津醫科大學一中心臨床學院器官移植中心，天津300192）

目前，對于小腸功能衰竭合并全胃腸外營養（total parenteral nutrition，TPN）并發癥的患者，小腸移植已成為公認的唯一能夠挽救生命的治療手段。隨著新型免疫抑制劑的應用和外科技術的改進，臨床小腸移植療效得到很大改善。根據第十二屆世界小腸移植大會報告（www.isbts2011.org）顯示，1985年4月-2011年8月，全球共有79個移植中心完成小腸移植2611例，其中1341例患者仍存活[1]，目前全球的小腸移植患者的總體1年和5年生存率已分別超過70%和50%。但是，與其他實質性臟器移植比較，小腸移植的效果仍不盡人意。移植后排斥繼感染之后，成為小腸移植術后死亡的第二大原因。誘導供體特異性移植耐受（donor specific transplant tolerance，DSTT）是近年來移植免疫耐受的研究重點，人們試圖通過誘導DSTT使移植物與宿主之間免疫反應達到平衡，從而防止移植后排斥反應的發生。近年來，隨著對抗原提呈細胞（antigen presenting cells，APC）特別是樹突狀細胞（dendritic cells，DC）的深入研究，發現DC不僅是最有效的APC而且是目前發現唯一能激活初始T細胞的APC，因此調控或干擾受體DC的致敏途徑在誘導移植免疫耐受方面起著重要作用。

1 DC的生理功能

樹突狀細胞由Steinman于1973年首次發現，是一類具有典型樹突狀形態的細胞，細胞膜表面高表達MHCII類分子和一些相對特異性表面標志，能夠移行至淋巴器官刺激初始T細胞活化增殖。DC根據來源分為髓樣DC和淋巴樣DC（或漿細胞樣DC）。正常情況下體內絕大多數DC處于未成熟狀態，低表達共刺激分子和粘附分子，體外激發混合淋巴細胞反應（mixed lymphocyte reaction，MLR）的能力較弱，但具有較強的抗原內吞和加工處理能力。DC在接受抗原和某些刺激因素刺激后分化成熟，高表達MHC I、II類分子、共刺激分子以及粘附分子（ICAM-1），體外激發MLR的能力很強，但抗原攝取加工能力大大降低。DC在成熟的同時，由外周組織進入淋巴管，激發T細胞應答。T細胞接受抗原刺激而激活，需要兩個刺激信號。“第一信號”為T細胞表面TCR/CD3與抗原MHC分子結合的抗原特異性信號，“第二信號”為APC上的共刺激分子與T細胞表面相應受體結合的抗原非特異性信號。共刺激分子提供的“第二信號”在T細胞活化上起重要作用，如果僅有“第一信號”，T細胞不能發生活化增殖，而且，在抗原識別時“第二信號”的缺乏將導致抗原特異性T淋巴細胞無能或凋亡。DC作為專職的APC，對免疫反應的進行起著至關重要的作用，因此也是誘導移植免疫耐受的關鍵所在。

2 DC與小腸移植免疫耐受

2.1 中樞免疫耐受 克隆清除或克隆無反應理論認為，T細胞在胸腺內發育過程中與自身MHC抗原發生反應，經過陰性選擇后，能與自身抗原發生反應的T細胞被清除[2]，而對自身抗原不發生反應的T細胞發育為成熟的T細胞遷出胸腺。盡管可能有一系列細胞參與了T細胞成熟過程中的陰性選擇，但DC在其中起最重要的作用。如果T細胞在胸腺內接觸到外周血DC攜帶的外周異基因抗原，就會被誘導出對該異基因抗原供體外周移植物的耐受作用。因此，可以將供體特異性抗原注入受體胸腺而誘導DSTT。1990年Posselt等[3]建立了大鼠胸腺內注射誘導耐受的動物模型，發現Wistar大鼠胸腺內注射Lewis大鼠的胰島細胞同時應用抗淋巴細胞血清可使移植胰島長期存活（>200d）。而將Lewis大鼠休眠的T細胞注射到ACI大鼠胸腺內聯合亞致死量全身照射能明顯延長小腸移植物存活時間[4]。此外，將供體骨髓細胞于術前注射到受體胸腺內，能顯著減少小腸移植后急性排斥的發生，甚至可以促進嵌合體的形成而誘導免疫耐受[5-6]。

2.2 外周免疫耐受 外周免疫耐受，即通過抑制T淋巴細胞的增殖及其活性，或選擇性減弱或消除DC上共刺激分子表達和活性，阻斷共刺激信號，在只有抗原特異性刺激信號作用的情況下，誘導T細胞無能和凋亡，從而誘導移植免疫耐受。

2.2.1 誘導生成未成熟DC 未成熟DC（immature dendritic cells，iDC）通過下調共刺激分子，MHC-II和Th1細胞因子可以誘導T細胞無能，因此維持DC的不成熟狀態可以誘導供體特異性免疫耐受[7]。通過控制體外培養條件（IL-10、糖皮質激素等），再經過脂多糖等刺激可以獲得iDC，并可觀察到其誘導免疫耐受的現象，而且這種iDC表型相對穩定，不易進一步分化成熟，可以持久發揮致耐受作用[8]。用GM-CSF+IL-4或GM-CSF+IL-10誘導產生的iDC在體外均可抑制效應性T細胞，且前者還能夠誘導抗原特異性T細胞無能，有利于免疫耐受的維持[9]。此外，1α，25（OH）D3與其受體結合后可特異性地抑制核因子-κB（nuclear factor，NF-κB）家族中RelB的表達，從而抑制DC的分化成熟，并可抑制Th1細胞介導的細胞免疫反應，誘導移植耐受[10]。在大鼠小腸移植模型中，經門靜脈注射供體骨髓來源的iDC可顯著延長受體存活時間，證實了iDC誘導免疫耐受的存在[11]。

2.2.2 基因修飾DC 基因修飾是針對移植免疫中抗原提呈、T細胞活化過程的主要環節，應用不同的目的基因轉染DC，使其表達抑制免疫的表面分子、分泌免疫抑制因子或阻斷效應T細胞活化，以達到誘導移植免疫耐受的目的。

IL-10是一種Th2細胞因子，能夠抑制Th1細胞因子合成，誘導Th1向Th2轉變。且應用抗原和IL-10反復刺激可誘導特異性調節性T細胞（Tregulatory cell，Treg）的增殖。這些都有利于免疫耐受的形成。IL-10與移植排斥反應呈負相關而與免疫耐受呈正相關[12]。經IL-10修飾的DC輸注可使小腸移植受體大鼠存活時間明顯延長，排斥反應程度更輕，驗證了IL-10修飾的DC誘導小腸移植耐受的作用[13]。Hui等[14]也證實IL-10基因修飾DC，可以抑制T細胞增殖并誘導其凋亡的致耐受作用。

轉化生長因子-β1（TGF-β1）與DC的分化成熟和功能狀態關系密切，能夠抑制DC表面MHC抗原及共刺激分子的表達誘導T細胞抗原特異性低反應而產生免疫耐受。在大鼠胰島移植中，通過TGF-β1基因修飾DC可使處理組胰島移植物存活時間明顯延長，提示TGF-β1-DC誘導了抗原特異性免疫耐受[15]。而在Wistar大鼠至SD大鼠肝移植的模型中，將TGF-β1基因修飾供體iDC經尾靜脈輸給受體，移植排斥反應明顯下降[16]。

此外，將CTLA4-Ig基因轉染的DC經靜脈注射到心臟移植后的小鼠，能夠延長同種異基因小鼠移植物存活時間[17]。趨化因子受體-7（Chemokine receptor-7，CCR7）、INF-α、Fasl等基因修飾DC，均可誘導不同程度的移植免疫耐受。單基因修飾雖然顯示出誘導免疫耐受的性質，但也表現出局限性，尚不能達到理想狀態的免疫耐受，聯合不同基因修飾DC協同誘導是今后器官移植耐受的一個研究方向。國內有學者聯合應用hFasL和hTGF-β1修飾iDC，發現可協同誘導同種異體大鼠肝移植免疫耐受，顯著延長肝移植大鼠的生存期[18]。

2.2.3 RNA干擾 RNA干擾（RNA Interference，RNAi）是利用構建的小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）或微小RNA（microRNA，miRNA）表達載體以特異的序列方式敲除目的基因表達。隨著近年RNAi技術的問世，應用RNAi加工改造DC誘導移植耐受的研究也越來越多。siRNA轉染DC是高效的，并且可調控DC介導的免疫反應[19]。利用siRNA-IL-12p35轉染DC，可刺激異基因T細胞向Th2細胞分化，促使IL-4表達上調而IFN-γ的表達下調，提示這種RNAi DC是一種致耐受DC，能維持機體的免疫耐受狀態，有望介導移植排斥的預防。Luo等[20]利用RNAi通過慢病毒載體有效沉默RelB基因來維持DC的不成熟狀態，從而誘導CD4+幼稚T細胞和CD4+記憶T細胞的低反應性。同樣，利用siRNA也可沉默RelB基因而降低DC表面MHCII類分子和CD80，CD86分子的表達，阻礙了DC成熟，能夠明顯阻止同種異體大鼠心臟移植排斥反應，誘導移植免疫耐受[21]。此外，將CD40siRNA轉染到DC，使共刺激分子CD40在DC表面表達下降，這種DC刺激T細胞增殖的能力下降，并使IFN-γ分泌減少，IL-4分泌增加，誘導幼稚型T細胞向Th2方向分化，有利于免疫耐受的建立[22]。近來在大鼠小腸移植的研究中，應用siRNA沉默骨髓源DC的髓樣分化因子88（My88）通路得到半成熟DC，有效抑制了同種異體T細胞的增殖，為誘導移植耐受提供了一種新的方法[23]。

2.2.4 調節性DC 調節性DC是一群異質性的免疫調節細胞，在維持機體免疫耐受和免疫應答穩態方面有重要作用，其表面標志具有多變性。低水平表達MHC分子及共刺激分子的調節性DC亞群，能夠誘導Treg生成，調節移植耐受。同時由于缺乏“第二信號”，不能活化初始T細胞誘導T細胞無能而降低T細胞免疫應答。調節性DC的致耐受作用也通過分泌具有負向調節作用的細胞因子（IL-10，INF等）誘導免疫反應向Th2偏倚而實現。Gregori等[24]利用1α，25（OH）D3誘導獲取的調節性DC聯合麥考酚嗎乙酯可以誘導對完全不相配的小鼠胰腺異體移植的耐受。而給自身免疫性腸病的小鼠輸入TGF-β基因修飾的調節性DC，可延緩了疾病的進展，同樣證實調節性DC可以誘導免疫耐受[25]。

2.2.5 調節性T細胞 在生理狀態下，外周組織中存在著大量iDC，在一定條件下通過上調CCR7獲得向淋巴結遷移的能力，在此過程中不斷攝取移植物抗原及非感染環境中的蛋白質，進入局部淋巴結，激發T細胞前體分化為Treg細胞，而Treg又可反作用于iDC，一方面通過合成大量IL-10和TGF-β下調DC表面MHC-II的表達，另一方面通過組成性CTLA-4依耐性通路下調DC表面CD40、CD80、CD86等共刺激分子的表達，抑制T細胞的增殖及活性，誘導移植免疫耐受[26]。研究表明免疫耐受中存在著自我維持調節回路，即耐受性DC誘導初始型T細胞轉化為Treg細胞，而Treg細胞則促進DC前體形成耐受性DC，二者之間存在著負反饋機制而維持平衡，說明iDC介導的免疫耐受可能是通過誘導Treg細胞來實現的[27]。Treg細胞主要包括CD4+CD25+Treg細胞、Th3細胞Tr1細胞和 CD8+Treg細胞[28]。供體產生的CD4+CD25+Treg細胞在體外可以有效地調控受體T細胞的產生，大劑量的Treg細胞注入受體，可能在人體肝移植免疫耐受中發揮重要作用[29]。Lim等[30]也發現，體外擴增的CD4+CD25+Treg細胞聯合免疫抑制劑能夠有效地建立免疫耐受。

2.2.6 單克隆抗體 T細胞的活化增殖不僅需要“第一信號”，且依賴DC表面的共刺激分子與T細胞表面的受體結合產生的共刺激信號。應用相應的共刺激分子單克隆抗體（monoclonal antibodies，mAb）及粘附分子mAb可以阻斷共刺激信號，從而誘導移植免疫耐受。如利用抗CD40LmAb阻斷CD40/CD40L通路，利用抗ICAM-1mAb阻斷LFA-1/ICAM-1通路。近年動物實驗使用抗CD2mAb、抗CD58mAb及LFA-3融合蛋白阻斷CD2/CD58通路，明顯延遲了移植排斥反應[31]。也有研究者用外源性細胞毒T淋巴細胞抗原4免疫球蛋白融合蛋白（CTLA-4Ig）有效阻斷B7/CD28通路，從而有效誘導了大鼠小腸移植免疫耐受，延長了小腸移植物的存活時間[32]。

2.2.7 免疫抑制劑 研究發現，多種免疫抑制劑可影響DC成熟，從而在誘導和維持移植后耐受方面發揮重要作用。如LF15-0195（15-脫氧精胍菌素的異構體）通過下調NF-κB和抑制IKK來抑制DC的成熟[33]。在大鼠骨髓來源的DC前體培養過程中加入環孢素A(1mg/L)，可以抑制DC表面共刺激分子的表達而發揮免疫耐受作用[34]。另有報道發現雷帕霉素通過抑制骨髓來源DC的功能激活誘導CD4+CD25+foxp3+Treg細胞的生成，從而促進器官移植免疫耐受[35-36]。

3 展望

器官移植是21世紀人類醫學的高峰，小腸移植因為嚴重的排斥反應而成為這座高峰上的一顆明珠，誘導移植后免疫耐受是小腸移植發展的重要突破點。作為體內重要的免疫細胞，DC介導雙向的免疫調節作用，既可以提呈抗原激活T細胞介導免疫應答，也可以誘導T細胞無能介導免疫耐受。有關DC誘導器官移植免疫耐受的研究在小腸移植方面有著廣闊的前景，特別是通過基因轉染以及RNAi等加工修飾DC，為免疫耐受的誘導提供了更多可選擇的方法，有望推動小腸移植的進一步發展。但同時也應認識到，DC誘導小腸移植免疫耐受真正應用于臨床還有很多問題需要解決，有待于進一步深入研究。

［1］ 淮明生，沈中陽.臨床小腸移植的國內外進展[J].國際移植與血液凈化雜志，2012，10（1）:17

［2］ Rutella S,Danese S,Leone G.Tolerogenic dendritic cells:cytokine modulation comes of age[J].Blood,2006,108（5）:1435

［3］ Posselt A M,Barker C F,Tomaszewski J E,et al.Induction of donor-specific unresponsiveness by intrathymic islet transplantation[J].Science,1990,249（4974）:1293

［4］ Chowdhury N C,Fawwaz R A,Oluwole S F.Induction of donorspecific tolerance to rat cardiac and small bowel allografts by intrathymic inoculation of donor T-cells[J].J Surg Res,1993,54（4）: 368

［5］ 羅長江，楊建軍，管文賢，等.異基因骨髓胸腺內輸注對大鼠小腸移植受者外周血嵌合體影響[J].華西醫學，2006，21（2）:313

［6］ 汝寶元，羅長江.異基因供體骨髓細胞胸腺內注射對腸移植大鼠的影響[J].中國組織工程研究與臨床康復，2007，11（29）:5684

［7］ Wang K L,Guo L,Shi R F,et al.Bioimmunological characteristics of mature or immature murine dendritic cells[J].Zhonghua Yi Xue Za Zhi,2011,91（45）:3225

［8］ Khindienst P,Wlethe C,Lutz M B,et a1.Simultaneous induction of CD4T cell tolerance and CD8T cell immunity by semimature dendritie cells[J].J Immunol,2005,174（7）:394l

［9］ Tiurb G,Matuschek A,K?mmerer U,et al.Inhibitory effects of rat bone marrow-derived dendritic cells on naive and alloantigenspecific CD4+T cells:a comparison between dendritic cells generated with GM-CSF plus IL-4and dendritic cells generated with GM-CSF plus IL-10[J].BMC Res Notes,2009,2（12）:1

［10］Griffin M D,Dong X,Kumar R.Vitamin D receptor-mediated suppression of RelB in antigen presenting cells:a paradigm for ligand-augmentednegativetranscriptionalregulation[J].ArchBiochem Biophys,2007,460（2）:218

［11］Sheng S D,Iwagaki H,Ozaki M,et al.Prolonged survival of donorspecific rat intestinal allograft by administration of bone-marrowderived immature dendritic cells[J].Transplant Immunol,2005,14（1）:17

［12］Gonzalez P,Burgaya F,Acarin L,et al.Interleukin-10and interleukin-10receptor-I are upregulated in glial cells after an excitotoxic injury to the postnatal rat brain[J].J Neuropathol Exp Neurol, 2009,68（4）:391

［13］劉芳，魏明發，朱珉，等.白細胞介素10修飾樹突狀細胞誘導大鼠小腸移植免疫耐受的研究[J].中華器官移植雜志，2003，24（6）:326

［14］Zhu H F,Qiu W H,Lei P,et al.IL-10gene modified dendritic cells inhibit T helper type 1-mediated alloimmune responses and promote immunological tolerance in diabetes[J].Cell Mol Immunol, 2008,5（1）:41

［15］趙剛，王芳，王春友.轉化生長因子-β1基因修飾樹突狀細胞誘導異種胰島移植耐受[J].中華普通外科雜志，2005，20（7）:428

［16］Liu N,Duan T D,Zhang N.Effects of TGF-betal gene medified donor dendritic cells on immune repulsion[J].Sichuan Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban,2006,37（5）:721

［17］Zhang X,Li M,Min W P,et a1.Generation of therapeutic dendritic cells and regulatory T cells for preventing allogeneic cardiac graft rejection[J].Clin Immunol,2008,127（2）:313

［18］曾金華，邱明鏈，陳麗紅，等.人凋亡相關因子配體及人轉化生長因子-β1基因共修飾樹突狀細胞誘導大鼠肝移植免疫耐受的研究[J].中華實驗外科雜志，2011，28（10）:1670

［19］Hill J A,Ichim T E,Kusznieruk K P,et a1.Immune modulation by silencing IL-12production in dendritic cells using small interfering RNA[J].J Immunol,2003,171（2）:691

［20］Luo L,Li C,Wu W,et al.Dendritic cells transduced with lentiviral vector targeting RelB gene using RNA interference induce hyporesponsiveness in memory CD4+T cells and naive CD4+T cells[J]. Cell Immunol,2012,273（1）:85

［21］Li M,Zhang X,Zheng X,et a1.Immune modulation and tolerance induction by RelB-silenced dendritic cells through RNA interference[J].J Immunol,2007,178（9）:5480

［22］Karimi M H,Ebadi P,Pourfathollah A A,et al.Immune modulation through RNA interference-mediated silencing of CD40in dendritic cells[J].Cell Immunol,2009,259（1）:74

［23］孟松，楊曉俊，朱春富，等.骨髓來源半成熟樹突狀細胞誘導大鼠小腸移植免疫耐受[J].中華實驗外科雜志，2010，27（6）:760

［24］Gregori S,Casorati M,Amuchastegui S,et al.Regulatory T cells induced by 1alpha,25-dihydroxyvitamin D3and mycophenolate mofetil treatment mediate transplantation tolerance[J].J Immunol, 2001,167（4）:1945

［25］Cai Z,Zhang W,Li M,et al.TGF-beta l gene-modified immature dendritic cells delay the development of inflammatory bowel dis easebyinducingCD4+Foxp3+regulatoryTcells[J].CellMolImmunol, 2010,7（1）:35

［26］Yamazaki S,Inaba K,Tarbell K V,et al.Dendritic cells expand antigen-specific Foxp3+CD25+CD4+regulatory T cells including suppressors of alloreactivity[J].Immunol Rev,2006,212（1）:314

［27］Min W P,Zhou D,Ichim T E,et al.Inhibitory feedback loop between tolerogenic dendritic cells and regulatory T cells in transplant tolerance[J].J Immunol,2003,170（3）:1304

［28］Kondeˇlková K,Vokurková D,Krejsek J,et al.Regulatory T cells（TREG）and their roles in immune system with respect to im munopathological disorders[J].Acta Medica（Hradec Kralove）, 2010,53（2）:73

［29］Demirkiran A,Bosma B M,Kok A,et a1.Allesuppressive donor CD4+CD25+regulatory T cells detach from the graft and circulate in recipients after liver transplantation[J].J Immunol,2007,178（10）:6066

［30］Lim D G,Koo S K,Park Y H,et a1.Impact of immunosuppressants on the therapeutic efficacy of in vitro-expanded CD4+CD25+Foxp3+regulatory T cells in allotransplantation[J].Transplantation,2010, 89（8）:928

［31］Greenwald R J,Chen Y,Demetris A J,et al.Relationship between TH1/TH2cytokines and CD2/CD58induce immune tolerance in liver transplantation in rats[J].Transplant Proc,2009,134（8）:2191

［32］Kurlberg G,Haglind E,Sch?n K,et al.Blockade of the B7-CD28pathway by CTLA4Ig counteracts rejection and prolongs survival in small bowel transplantation[J].Scand J Immunol,2000,51（3）:224

［33］Zhang X S,Li M,Lian D M,et al.Generation of therapeutic dendritic cells and regulatory T cells for preventing allogeneic cardiac graft rejection[J].Clin Immunol,2008,127（3）:313

［34］孫世波，孫景武，王峰，等.環孢素對大鼠骨髓來源樹突細胞成熟及同種免疫刺激活性的影響[J].醫學研究生學報，2007，20（8）:819

［35］Pothoven K L,Kheradmand T,Yang Q,et al.Rapamycin-conditioned donor dendritic cells differentiate CD4CD25Foxp3T cells in vitro with TGF-β1for islet transplantation[J].Am J Transplant, 2010,10（8）:1774

［36］Raimondi G,Sumpter T L,Matta B M,et al.Mammalian target of rapamycin inhibition and alloantigen-specific regulatory T cells synergize to promote long-term graft survival in immunocompetent recipients[J].J Immunol,2010,184（2）:624