牛肉和豬肉基質(zhì)中多農(nóng)藥殘留GCMS分析方法

劉潤珠，王松，崔鶴，高建國，張靖坤，張文皓

（1.山東出入境檢驗檢疫局食品農(nóng)產(chǎn)品中心，山東青島266002；2.青島出入境檢驗檢疫局，山東青島266001；3.美國賽默飛世爾科技中國公司，山東青島266032）

由于長期大量使用與濫用，農(nóng)藥已成為食品的重要污染源之一，特別是隨著我國人民生活水平的提高，肉、水產(chǎn)品、蛋、乳類等動物源性食品在居民膳食結(jié)構(gòu)中所占的比例越來越大。通過環(huán)境接觸、食物鏈富集等進(jìn)入動物體內(nèi)的農(nóng)藥殘留問題成為了關(guān)注熱點[1-6]。

近年來我國在蔬果、茶葉等植物源性食品及水體、土壤等環(huán)境中的農(nóng)殘檢測上已取得了較大進(jìn)展，但針對動物源性食品農(nóng)藥殘留檢測，尤其是同時測定不同類型農(nóng)藥殘留的多殘留檢測則較少研究，檢測技術(shù)上的差距還導(dǎo)致我國出口動物源性食品遭遇歐美日等發(fā)達(dá)國家的技術(shù)性貿(mào)易壁壘。因此，提高我國動物源性食品農(nóng)藥多殘留檢測水平，顯得十分重要和緊迫[7]。

凝膠滲透色譜法（gel-permeation chromatograph，GPC）是一項成熟的農(nóng)藥殘留凈化技術(shù)[8]，其主要原理是根據(jù)不同體積的分子在凝膠色譜柱保留的時間差異，來分離目標(biāo)物。針對動物源樣品中動物源樣品中含有大量的脂肪、蛋白質(zhì)和有機(jī)酸類物質(zhì)，能把農(nóng)藥殘留從各種復(fù)雜基質(zhì)中分離出來，但同時有些近似分子量的干擾物可能會被夾帶洗脫，不能達(dá)到完全凈化，因此有時需要與其他技術(shù)連用，做進(jìn)一步凈化。我們以乙腈為溶劑，將動物源樣品均質(zhì)提取，提取液用GPC 除去脂類、蛋白質(zhì)和大部分大分子雜質(zhì)[9]，再經(jīng)SAX/PSA 固相萃取[10]，進(jìn)一步除去樣品中可能含有的有機(jī)酸等極性雜質(zhì)，此方法可以實現(xiàn)樣品的無擾動分析，能夠大幅提高萃取效率，可以使檢測儀器的靈敏度提高。

1 材料和方法

1.1 儀器和材料

QP2010plus 氣相色譜-質(zhì)譜儀：島津，配EI 源和自動進(jìn)樣器；T25 型均質(zhì)器：IKA；39760 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：Thermolyne 公司；5810R 型離心機(jī)：Eppendorf 公司；凝膠色譜儀：L2，配有單元泵、餾分收集器。

30%丙酮/正己烷溶液（取300mL 丙酮，加入700mL正己烷，搖勻備用）；50%丙酮/正己烷溶液（取500 mL丙酮，加入500 mL 正己烷，搖勻備用）；50%環(huán)己烷/乙酸乙酯（取500 mL 環(huán)己烷和500 mL 正己烷，搖勻備用）；含500 ng 菲氘體的轉(zhuǎn)溶液（取0.5 mL 的1 000 μg/mL菲氘體溶液加入500 mL 丙酮，500 mL 正己烷，搖勻備用）；NaCl 飽和2 mmol/L 磷酸緩沖溶液（量取1000 mL純水，攪拌下加入210 g 磷酸氫二鉀、120 g 磷酸二氫鉀和200 gNaCl 至固體完全溶解，用NaOH 溶液調(diào)pH至7.5）；單標(biāo)儲備液（分別稱取10 mg～20 mg 農(nóng)藥各標(biāo)準(zhǔn)物分別于10 mL 容量瓶中，用丙酮或乙腈定容至刻度，置于-18 ℃以下冷凍保存）；混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（分別準(zhǔn)確移取各種標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用丙酮配制成濃度為10 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)液，置于-18℃以下冷凍保存）。

1.2 方法

1.2.1 提取

稱取10 g 試樣（精確至0.01 g）于250 mL 燒杯中，加入乙腈40 mL、純水10 mL，棒狀均質(zhì)器約10 000 r/min下均質(zhì)提取2 min，然后抽濾（若不能順利濾下，可在樣品中加1 g～2 g 硅藻土），用15 mL 乙腈分兩次清洗均質(zhì)杯，并入接收瓶。將提取溶液調(diào)pH 至中性，然后轉(zhuǎn)入已盛有NaCl 的分液漏斗中，少量乙腈沖洗燒杯，振蕩3 min，靜置10 min。棄去水層，取乙腈層于蒸餾瓶內(nèi)，乙腈沖洗蒸餾瓶瓶口，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器于40 ℃下減壓濃縮至干。加入10 mL50%環(huán)己烷/乙酸乙酯溶解殘渣，用0.45 μm 濾膜過濾，待凝膠色譜（GPC）凈化。

1.2.2 凝膠色譜（GPC）凈化

凝膠凈化柱：Bio Beads S-X3 7 mm×250 mm；流動相：50%環(huán)己烷/乙酸乙酯；流速：4.7 mL/min；樣品定量環(huán)：10 mL；預(yù)淋洗時間：10 min；凝膠色譜平衡時間：5 min；收集時間：23 min～31 min。將10 mL 待凈化液進(jìn)行凈化，收集23 min～31 min 區(qū)間的組分，于40 ℃下濃縮至近干，待固相萃取凈化。

1.2.3 固相萃取（SPE）凈化

SAX/PSA 柱預(yù)先用30 %的丙酮/正己烷溶液（5 mL×2）平衡，3 mL 30%的丙酮/正己烷溶液加入蒸餾瓶內(nèi)，移入柱內(nèi)，50 mL 蒸餾瓶接收，使用30 mL 30%丙酮/正己烷沖洗蒸餾瓶，并移入SAX/PSA 柱進(jìn)行洗脫接收，當(dāng)液面降至與填料齊平時，該流出液作為第一部分；再用50%的丙酮/正己烷溶液30 mL 洗脫，真空抽干，流出液作為第二部分。第一部分、第二部分分別使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器在40 ℃下減壓濃縮至近干，氮?dú)獯蹈桑院?00 ng 菲氘體的轉(zhuǎn)溶液定容2 mL 后，用于氣相色譜-質(zhì)譜測定。

1.2.4 儀器測定

色譜柱：DB-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）石英毛細(xì)管柱或相當(dāng)者；色譜柱溫度：60 ℃保持3 min，然后以10 ℃/min 程序升溫至150 ℃，再以2 ℃/min 升溫至220 ℃，再以10 ℃/min 升溫至280 ℃，保持9 min；載氣：氦氣，純度≥99.999 %，流速：1 mL/min；進(jìn)樣口溫度：260 ℃；進(jìn)樣量：1 μL；進(jìn)樣方式：無分流進(jìn)樣，2 min后開閥；電子轟擊源：70 eV；離子源溫度：200 ℃；GCMS 接口溫度：280 ℃；選擇離子監(jiān)測：多離子監(jiān)測；溶劑延遲：8 min。

2 結(jié)果與討論

2.1 結(jié)果分析

在確定的儀器條件下，50、100、200 μg/L 3 種濃度，三點線性相關(guān)系數(shù)均超過0.999，通過S/N=10 計算得儀器定量限在1.0 μg/kg～13.9 μg/kg，方法定量限為0.2 μg/kg～2.8 μg/kg，均小于10 μg/kg 的一律基準(zhǔn)要求，完全滿足大規(guī)模篩查的需要。

同時，通過對牛肉、豬肉兩種基體進(jìn)行50、100、200 μg/kg 3 種不同濃度的添加回收實驗，回收率在65.1%～124.7%，由于測定項目較多，其中由于動物源性基質(zhì)的成分較為復(fù)雜，雖通過GPC 與SPE 兩種凈化手段仍在部分農(nóng)藥測定方面存在很強(qiáng)的基質(zhì)效應(yīng)，因此，檢測過程中使用了基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行定量。

2.2 討論

2.2.1 提取溶劑的選擇

目前多農(nóng)殘分析中主要使用的提取溶劑為丙酮、乙腈和乙酸乙酯，其中丙酮與水良好的互溶性會在凈化過程中帶來一定的繁瑣；而乙酸乙酯對于非極性雜質(zhì)，特別是甾醇類等大分子雜質(zhì)的提取效率相對較高，因此目前主流的多農(nóng)藥殘留分析方法一般均采用乙腈作為提取溶劑。我們在這個方法中也選擇了乙腈作為提取溶劑，取得了滿意的結(jié)果。提取過程中選擇

乙腈作為溶劑，加入水的主要目的是為了潤濕樣品，增加乙腈對肌肉的滲透性，可將肌肉組織分散的非常均勻，提高提取效率[11]。

表1 質(zhì)譜相關(guān)檢測參數(shù)Table1 Mass spectrometry detection parameters

2.2.2 凈化

2.2.2.1 SPE 凈化柱選擇

從SPE 柱的填料性質(zhì)分析，SAX/PSA 雙層小柱含有上層的SAX 和下層的PSA 兩種填料，綜合了SAX 和PSA 的優(yōu)勢，SAX 可吸附基質(zhì)中幾乎所有的酸性雜質(zhì)，PSA 可有效去除食品中的脂肪酸，有機(jī)酸、極性色素和糖類。由于動物源基質(zhì)中經(jīng)過GPC 處理后，已經(jīng)去除大部分的大分子雜質(zhì)干擾，其余干擾物多為脂肪酸、有機(jī)酸類物質(zhì)，選用SAX/PSA 作為SPE 過程的凈化柱，能有效得去除干擾雜質(zhì)。

2.2.2.2 pH 調(diào)節(jié)

在液液分配過程中水相的pH 對于農(nóng)藥的回收率有著相當(dāng)大的影響：在酸性條件下，存在某些農(nóng)藥回收率較低的情況；而大部分有機(jī)磷農(nóng)藥在堿性條件下存在不穩(wěn)定性，為了保證在液液分配過程的穩(wěn)定性，因此在液液分配過程中需要使用緩沖溶液調(diào)整pH 到中性。

2.2.2.3 濃縮

在最后旋轉(zhuǎn)濃縮過程中，實驗發(fā)現(xiàn)濃縮的方式和程度對于易揮發(fā)組分尤其是DDVP 的回收率影響相當(dāng)大，氮吹至干的時候一般DDVP 的回收率都會低于30%，而使用旋轉(zhuǎn)濃縮的方式濃縮至近干的時候回收率會相對較好，特別是在濃縮前加入少量正十烷，一方面可以防止最后濃縮至近干時敵敵畏的損失，另一方面在氣相檢測的時候高沸點溶劑起到溶劑聚焦的作用有利于改善峰形。

3 結(jié)論

本方法針對于動物源產(chǎn)品中經(jīng)常檢出的208 種農(nóng)藥，建立了凝膠色譜/固相萃取氣質(zhì)聯(lián)用檢測分析方法。本方法的凈化力度比較大，對于目前常見樣品，這個方法足以滿足日本肯定列表一律基準(zhǔn)的要求，但是綜合來講，這個方法的凈化步驟較多，凈化步驟越多，前處理過程中出現(xiàn)損失的可能就越多，因此對于這個方法的日常使用來講，人員操作的熟練程度和實驗室整體質(zhì)量控制質(zhì)量保證手段決定了這個方法的實際應(yīng)用效果。另外，由于本方法包括的農(nóng)藥面比較寬，極性分布比較廣，有利于今后新農(nóng)藥品種的增減。

[1] 仲維科,郝戩,孫梅心,等.我國食品的農(nóng)藥污染問題[J].農(nóng)藥,2000,39(7):1-4

[2] 趙云峰,吳永寧,王緒卿,等.中國居民膳食中農(nóng)藥殘留的研究[J].中華流行病學(xué)雜志,2003,24(8):661-664

[3] 汪建紅,李雪紅,張保欣.動物源性食品的藥物殘留和化學(xué)污染物對人類毒性作用及畜產(chǎn)品安全達(dá)標(biāo)對策[J].新疆畜牧業(yè),2003(2):8-9

[4] 文利俠,李舒強(qiáng).動物源性食品安全問題與對策[J].畜牧獸醫(yī)雜志,2013,32(1):69-74

[5] 韋鳳棲,莫靜波.食品中農(nóng)藥殘留檢測的樣品前處理技術(shù)進(jìn)展[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志,2012,22(3):678-680

[6] 程文杰.食品中農(nóng)藥殘留檢測技術(shù)研究進(jìn)展[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志),2011,2(2):534-535

[7] 李君君,李力軍,徐惠誠,等.動物源性食品中農(nóng)藥多殘留檢測前處理技術(shù)研究進(jìn)展[J].中國食品衛(wèi)生雜志,2012,24(4):403-407

[8] 費(fèi)勇,楊曉紅,張海燕,等.全自動凝膠色譜凈化-氣相色譜法同時測定淡水魚類中多氯聯(lián)苯和有機(jī)氯農(nóng)藥等36 種殘留有機(jī)物[J].中國環(huán)境監(jiān)測,2011(2):63-68

[9] 楊立新,苗虹,曾凡剛,等.動物源性食品中有機(jī)磷農(nóng)藥殘留檢測技術(shù)研究進(jìn)展[J].中國食品衛(wèi)生雜志,2010,29(3):241-244

[10] SCHENCK F J.DONOGHUE D J.Determination of Organochlorine and Oranophosphorus Pesticide Residues in Eggs Using a Phase Extraction Cleanup[J].J Agric Food Chem,2000,48(12):6412-6415

[11] 蘇建峰,林谷園,連文浩,等.兩種水產(chǎn)品中農(nóng)藥多殘留分析的樣品前處理方法及其在111 種農(nóng)藥和相關(guān)化學(xué)品殘留同時檢測中的應(yīng)用[J].色譜,2008,26(3):292-300