質譜技術及其在臨床檢驗中的應用

韓麗喬 綜述，莊俊華，黃憲章 審校

(廣州中醫藥大學第二臨床醫學院檢驗科，廣東 廣州 510120)

質譜(mass spectrometry，MS)技術是一種重要的檢測分析技術，通過將待測樣本轉換成高速運動的離子，根據不同的離子擁有不同的質荷比(m/z)進行分離和檢測目標離子或片段，然后依據保留時間和其豐度值進行定性和定量[1]。近年來，質譜技術發展迅速，通過改進離子源和分離器相繼發展了多種類型的質譜儀如電噴霧離子源質譜(ESI-MS)、大氣壓化學電離離子源質譜(APCI-MS)、四級桿(QQQ)質譜儀、離子阱質譜技術以及各種串聯、聯用質譜儀等多種類型，極大提高了檢測的分辨率和檢測范圍。質譜技術最先應用于計量和分析化學領域，在臨床檢驗中質譜仍屬于一種年輕的檢測方法。但自從其在臨床檢驗應用以來，便以其高靈敏度、低檢測限、樣本用量少、高通量、檢測速度快、樣本前處理簡單的優勢顯示出巨大的生命力，尤其和氣相、高效液相色譜儀的聯用極大的擴展了質譜技術在臨床檢驗中的分析范圍。

一、質譜儀的組成

質譜儀主要有5個部分組成:進樣系統、離子源、質量分析器、檢測器和數據處理系統。其核心部件是離子源和質量分析器。離子源的功能是將由進樣系統引入的樣本分子轉化成離子，包括硬電離方法和軟電離方法。硬電離方法給予樣本較大的能量，如電子轟擊電離、化學電離、場致離子化電離等;軟電離方法是一種比較溫和的離子化方式，包括快原子轟擊電離、大氣壓化學電離、大氣壓光致電離、電噴霧電離、基質輔助激光解吸電離等類型。硬電離方法適用于一些小分子化合物的分析，軟電離適用于分子量較大的化合物，尤其是一些生物分子，如蛋白質、多肽、寡聚核苷酸等。質量分析器主要是將電離產生的離子根據其不同的質荷比來分離目標離子，其主要類型有單聚焦、雙聚焦、擺線、磁分析器、飛行時間、四級桿質量分析器、離子阱分析器、傅立葉變換離子回旋共振質譜等類型。此外儀器還需要在高真空環境中進行離子分離，因此真空系統也是質譜儀必備的組成部分[2]。

二、質譜儀的工作原理

質譜儀的基本工作原理:待測樣本由進樣系統進入離子源內電離成離子進入質量分析器，然后質量分析器據形成的離子的m/z進行分離，后進入檢測器檢測，數據系統將離子信號轉換成譜圖進行質譜解析或定量分析。目前生命科學領域中的質譜儀大都由幾種質量檢測器串聯組成，這樣可以提高離子分離效率，使檢測更具特異性和準確度[3]。

三、質譜儀在臨床檢驗中應用

(一)在微生物檢驗方面的應用

傳統的致病微生物檢測大多采用微生物培養、生物化學和分子生物學的方法檢測，不僅分析周期長而且沒有明確的種群分型標準，往往造成分析結果的滯后和種類分型的誤判。據估計，在臨床實驗室中僅在鏈球菌的分類中，就有高達13%的辨別錯誤[4]。近年來，質譜技術在微生物檢驗方面的應用越來越多，這主要得益于其得天獨厚的優勢:(1)可用于多種微生物樣本，如痰液、血液、尿液、腦脊液和胸腹腔積液以及經過培養的樣本;(2)可用于幾乎所有類型的病原體鑒定和分類檢測，如細菌、真菌及其孢子、病毒、寄生蟲等;(3)可對病原的多種成分進行分析，包括蛋白質、脂質、脂多糖、脂寡糖、DNA、多肽及其他可被離子化的分子;(4)檢測速度快，例如一個病原微生物的質譜檢定實驗，包括樣本的采集和制備，整個過程不到 10 min[5];(5)樣本用量少;(6)樣本前處理簡單;(7)特異性和準確性高，例如金黃色葡萄球菌的表型鑒定，Rajakaruna等[6]利用基質輔助激光解吸/電離-飛行時間質譜(SELDITOF-MS)技術分析了來自臨床實驗室的95個分離群和39個葡萄球菌群，并利用MicrobeLynx軟件成功的識別了各個種群;(8)高敏感性，例如液相串聯質譜可以檢測到10～100個細菌或20～50個孢子的存在。在對生物樣本進行處理后，甚至可以在單個菌水平發現并確定致病菌[7]，使其在微生物尤其是傳染病病原體鑒定方面具有巨大的優勢。近年來已建立了微生物胞膜蛋白質、脂多糖、核酸等的指紋數據庫，使其檢測更加準確和快速。

目前在細菌檢測中應用較多是飛行質譜技術。通過檢測細菌胞膜成分或表達的特異蛋白對細菌進行種群的鑒別，不僅可以識別病原菌，而且有助于發現新的病原菌。此外還有用于病原體的藥物敏感性實驗檢測和真菌檢測研究等[8-9]。

(二)質譜技術在臨床免疫學檢驗的應用

飛行質譜技術的全稱是表面增強激光解吸電離飛行時間質譜技術(surface enhanced laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，SELDI-TOF-MS)，是利用相同能量的帶電粒子，由于質量的差異而具有不同速度從而以不同時間通過相同的漂移距離到達接收器，依據離子束到達檢測器的時間推算出m/z，從而進行定性和定量檢測。其高靈敏度、高通量的分析特點使其在臨床免疫學檢驗生物標志物檢測方面成為一項有力的工具，篩選作用獨特高效。如前列腺癌及前列腺增生、卵巢癌、胰腺癌、膀胱癌、乳腺癌、肺癌、肝癌、腎癌、結腸癌、喉癌、鼻咽癌、食道癌等，都發現了特異的蛋白或某些蛋白的增加或者減少[10-13]。尤其質譜檢測技術在泌尿系統中的應用發展迅速。由于其檢測的樣本為尿液，對患者身體不造成傷害，不僅可以早期診斷腎臟疾病，而且避免或減輕了傳統侵入性方法如腎臟活檢等給患者帶來的痛苦，提高患者治療的依從性和存活率。在腎臟腫瘤、糖尿病性腎臟病變、腎臟移植功能檢測等具有很大應用前景[14]。此外毛細管電泳質譜技術被廣泛用于泌尿系統peptidomical生物標志物的研究，驗證了許多已經報道的但是沒有蛋白和肽段識別的研究結果[15]。

Agger等[16]采用液相色譜-多重反應檢測-質譜(LC-MRM/MS)方法通過同時定量測定血漿樣本中載脂蛋白A-Ⅰ和載脂蛋白B來推進質譜方法同時定量多種血漿/血清中蛋白質在臨床前期的生物標志物大規模篩選以及取代價格昂貴的免疫測定方法作為實驗室檢查的常規方法的應用。結果表明LC-MRM/MS與傳統免疫學方法相關性良好且具有大規模應用于臨床研究的可行性。因其簡化了樣本的前處理以及樣本前處理中蛋白消化作用帶來的變異，具有潛在的應用前景。

(三)在臨床生物化學檢驗中的應用

1.在體內激素檢測方面的應用 質譜技術在臨床生物化學中一項重要的應用是用于體內激素的檢測，如類固醇激素(甾體激素)及其代謝產物的檢測，具有極重要的臨床診斷價值，幾乎可以診斷所有的類固醇相關障礙性疾病。如睪酮(T)、雙氫睪酮(DHT)、血漿雌酮硫酸鹽、雌酮、雌二醇和雌三醇等的定量檢測，可輔助多種激素相關疾病及激素替代治療疾病如兒科遺傳性激素相關疾病、先天性腎上腺增生癥、家族性高醛甾酮過多癥、多囊卵巢病、成人生殖系統和第二性征的維持、前列腺增生和前列腺癌、原發性醛固酮增多癥、腎上腺機能減退、雌激素缺乏及抗雌激素藥治療、腎上腺功能異常(如Cushing's綜合癥)的診斷、監測、治療和研究等[17-18]。

2.在血藥濃度監測和藥物代謝研究中的應用 臨床中某些藥物效用范圍比較窄，很容易引起毒性反應，造成不良后果。如免疫抑制劑隨著器官移植技術和移植成活率的提高越來越多的應用于患者，其在人體內過多和過少都會給患者帶來很大的痛苦。但這些藥物在體內的濃度往往很低，給檢測帶來一定的困難。近幾年隨著質譜技術的發展，其高靈敏度、高特異性和檢測速度快的優勢使其已成為藥物濃度檢測的重要工具。特別是在免疫抑制藥物、抗腫瘤藥物、抗逆轉錄病毒(HIV)藥物、抗精神病藥物、一些激素類藥物、中藥及其天然產物分析、藥物濫用(如嗎啡、鴉片和一些鎮痛藥)、麻醉藥、中毒藥物的急救中得到廣泛應用，并且質譜技術被公認為生物樣本中藥物及其代謝產物檢測的標準化方法[19-20]。此外有報道通過用飛行質譜方法進行單鏈核苷酸多態性的快速基因分型從而指導華法林(抗凝血藥)用量的研究[21]。這為新的多重基因分型方法提供了一個非常好的臨床檢驗平臺，促進個體化藥物治療的研究。

3.在遺傳性疾病檢測中的應用 質譜技術在遺傳性疾病的診斷和篩查中應用廣泛。最為大家熟知的就是質譜技術在新生兒篩查檢測中的應用，通過檢測氨基酸、脂肪酸、有機酸及其代謝產物可以靈敏、準確地檢測出20多種遺傳代謝疾病，從而早期診斷、早期治療，挽救了很多患兒的生命和人生[22-23]。還有報道質譜技術用于快速篩查嘌呤和嘧啶代謝紊亂高危患者的研究，快速且特異，彌補了該種遺傳病表型表現多樣性和非特異性給診斷帶來的困難[24]。孫衛華等[25]采用氣相色譜質譜聯用技術(GC-MS)測定尿琥珀酰丙酮(SA)，精確性和準確性均較高，為臨床上鑒別診斷酪氨酸血癥I型提供了新的方法。

4.痕量元素/微量營養素檢測中的應用 電感耦合等離子體質譜分析技術(ICP-MS)是20世紀80年代發展起來的無機元素分析檢測技術，近年來在痕量、超痕量成分及同位素分析檢測中廣泛應用。ICP-MS是在樣本處理前加入待測元素的同位素，利用其測定前后的豐度比例改變而達到測定目的。可以同時測定多種痕量元素，具有檢測限低、動態線性范圍寬、干擾少、穩定性好、分析精密度高、速度快、樣本前處理簡單、高通量等諸多優點，是最準確的無機元素分析方法之一。目前已廣泛應用于血清、全血、尿液以及頭發中鉛(Pb)、砷(As)、鐵(Fe)、硒(Se)、鋅(Zn)等有害重金屬元素和人體微量元素的測定，可輔助臨床疾病和職業病的診斷和鑒別診斷等。但是其一個最大的缺點是昂貴的耗費以及某些重金屬元素比如鉻和鐵等有較多的干擾[26]。此外，質譜技術還可應用于人體微量營養元素的檢測，如B12、維生素D等，對于診斷人體相關微量營養素異常導致的疾病具有重要臨床應用意義。

5.糖化血紅蛋白的檢測應用 糖化血紅蛋白(HbA1c)被認為是診斷糖尿病的最好指標。Nakanishi等[24]報道用電噴霧電離質譜法(ESI-MS)檢測HbA1c并與傳統方法比較，結果顯示ESI-MS方法與傳統方法的相關性高于96%，而且重復性非常好，在臨床檢驗常規方法的質量控制中可以起到很大作用。

(四)在分子生物診斷中的應用

1.蛋白組學和核苷酸多態性的研究應用 質譜技術應用領域中的另一個重要方面是蛋白質組學研究。2002年軟電離技術被授予諾貝爾化學獎。生物質譜技術也成為質譜學中最具有活力的前沿熱門技術。其可以檢測蛋白質的氨基酸組成、分子量、多肽或二硫鍵的數目和位置及蛋白質的空間構象等;還用于檢測核酸的分子量和單核苷酸多態性(即基因位點的突變)研究。其準確、靈敏和高通量的特點已經成為檢測蛋白及多肽分子和基因的重要技術[28-29]。通過MALDI-TOF-MS檢測尋找特異的一組蛋白質峰，建立腫瘤早期血清差異表達蛋白的診斷模型，對早期快速診斷腫瘤提供可能。已有研究報道用于多種腫瘤的早期診斷。單核苷酸多態性是指DNA序列上發生的單個核苷酸堿基之間的變異，在人群中的發生頻率＞1%，是決定疾病易感性和藥物反應性差異的重要因素。通過檢測突變的位點可以對疾病進行預測，提供診斷意見和用藥指導并探討與疾病發生的相關性。因為MALDI-TOF-MS檢測的是核苷酸本身的分子量，相較于傳統的單核苷酸多態性分型檢測方法更為省時、省力和可靠。

2.代謝組學研究的應用 人體是一個復雜的生化大工廠。當某部件出現異常時必然會伴隨著某些代謝小分子的水平異常。相對來說這些小分子比DNA、RNA、蛋白質等更能反應一個細胞當前的功能狀態。代謝組學也是目前研究的一個熱點，質譜技術在檢測這些代謝小分子的變化上也有重要的應用，為多種疾病及腫瘤的更早期診斷和指導治療提供依據[30]。如張文亮等[31]采用毛細管電泳與MALDI-TOF-MS聯用測定血清轉甲狀腺素蛋白的化學修飾，為進一步探索淀粉樣變性的發病機制提供了一種簡便的檢測方法。

(五)在參考方法建立和研制標準物質方面的應用

在臨床檢驗中基于準確性的標準化檢測是目前急需的。1997年國際物質量咨詢委員會(CCQM)將同位素稀釋質譜(ED-ID-MS)原理定為一級(基準)測量原理之一，其同時具有質譜分析的高度特異性和同位素稀釋的高度精密性，且測量的動態范圍寬，樣本制備不需嚴格定量操作，測量值能夠直接溯源到國際單位制的物質量基本單位“摩爾”。因此基于同位素稀釋質譜原理的方法在生物和臨床化學溯源研究中受到越來越多的重視，為臨床檢驗中標準物質的研制提供了技術保障，是臨床檢驗參考方法的最佳選擇。

Thienpont等[32]建立基于常規實驗室的EDID-MS法檢測游離T3和T4通過IFCC的候選國際傳統參考測量程序方法的校準和溯源，檢測指標都取得了很好的相關性。張傳寶等[32]應用同位素稀釋液相色譜串聯質譜法建立了測定血清尿酸的候選參考方法。

四、結語

質譜技術，尤其是串聯質譜技術可以提供物質的結構和質量信息。因此其在定性和定量生物樣本中的作用越來越大，同時也適合一些探索性的工作。MALDI-TOF和SELDI質譜儀近來被廣泛用于一些標志性物質的探索。三重四級桿線性離子阱分析器的發展使分析器定量的能力與離子阱的掃描能力相結合，從而可以容納掃描器組合的不同排列。選擇性反應物探測的組合和三重質譜技術的組合(MS/MS/MS)是一個定量的很好組合。電噴霧離子化、大氣壓光致電離是近年來發展迅速的離子源，可以檢測極性和非極性化合物。

質譜技術雖然有很多的優點，在近年來很多領域的應用也發展迅速，但其也有自身的瓶頸:如沒有某純物質為內標或特征性的離子碎片，則難以判斷該物質是何種物質，無法定性和定量，所以目前還有許多物質無法用質譜檢測，尤其是一些大分子的復雜物質;目前質譜技術的自動化程度還還相對較差，前處理過程也相對復雜，其對工作人員的技術要求較高;另外儀器昂貴，日常運行費用及維護費用也較高，如ID-MS儀器，在處理樣本時需要加入適量的同位素稀釋劑，該種稀釋劑來源較困難，制備成本較高等，這些都為ID-MS的普及應用帶來困難;此外該技術的高敏感性，如SELDI-TOF-MS技術篩檢蛋白的高敏感性必然帶來了檢測的假陽性，這也是該技術不容忽視的一個弱點。但相信隨著質譜技術的發展成熟，其在臨床實驗室檢測中會有更廣泛的應用。

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