鱈魚骨膠原蛋白肽的抗氧化活性

趙 玲， 李 亞， 劉 淇*， 曹 榮

（1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院 黃海水產(chǎn)研究所，山東 青島 266071；2.山東永康食品有限公司，山東 煙臺264006；3.煙臺嘉惠海洋生物科技有限公司，山東 煙臺 264006）

隨著水產(chǎn)品加工技術(shù)和食品冷鏈物流技術(shù)的進(jìn)步，以冷凍魚片、預(yù)調(diào)理水產(chǎn)品為代表的水產(chǎn)品加工業(yè)得到了快速發(fā)展。與此同時，在水產(chǎn)品加工過程中產(chǎn)生了大量的魚皮、魚骨等下腳料尚未得到充分利用。因此，綜合利用水產(chǎn)品加工下腳料，不僅是水產(chǎn)品加工的一個重要研究方向，也是提高水產(chǎn)品加工業(yè)經(jīng)濟(jì)效益和社會效益的必然要求。

研究表明，魚骨可用于制作多種食品，也可用于提取膠原蛋白、軟骨素及制備CMC活性鈣等[1]。目前，國內(nèi)外關(guān)于從魚類加工下腳料中制備膠原蛋白或肽制品的研究報道很多[1-5]，其中以魚皮為原料的研究居多[6]，而關(guān)于魚骨膠原蛋白的研究相對較少。抗氧化肽以其相對分子質(zhì)量小、易吸收、活性強(qiáng)等特點(diǎn)受到重視，在醫(yī)藥、化妝品、保健品和食品與飼料添加劑等方面有廣闊前景[7-8]。作者以鱈魚骨為研究對象，旨在通過對其膠原蛋白肽的抗氧化活性研究，為鱈魚骨在保健食品和醫(yī)藥等領(lǐng)域的開發(fā)與利用提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鱈魚排:太平洋真鱈（Gadus macrocephalus）加工下腳料，煙臺嘉惠海洋生物科技有限公司提供。

中性蛋白酶（1.3×105U/g）:吉寶（青島）生物科技有限公司產(chǎn)品；復(fù)合蛋白酶（1.0×105U/g）:諾維信生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；酸性蛋白酶（5.0×104U/g），北京東華強(qiáng)盛生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；胃蛋白酶（≥1.2×103U/g），國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；其它試劑均為分析純。

1.2 主要儀器

數(shù)顯恒溫水浴鍋HH-2，國華電器有限公司產(chǎn)品；N-1001型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀:上海愛朗儀器有限公司產(chǎn)品；CoolSafe 110 Freese Dryer:LABGENE公司產(chǎn)品；UV-2082型紫外可見分光光度計:尤尼柯 （上海）儀器有限公司產(chǎn)品；PB-10型 pH計:Sartorius公司產(chǎn)品；L-550型臺式低速離心機(jī):湘儀離心機(jī)儀器有限公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 鱈魚骨膠原蛋白的提取 提取工藝流程:鱈魚排→漂燙→去肉→清洗→熱水浴提取→過300目篩→微濾→真空濃縮→醇沉→冷凍干燥→鱈魚骨膠原蛋白粉

1.3.2 鱈魚骨膠原蛋白肽的制備 取粗制的鱈魚骨膠原蛋白粉配制成質(zhì)量濃度為10 mg/mL的溶液，分別用中性蛋白酶、復(fù)合蛋白酶、胃蛋白酶、酸性蛋白酶在各自最適酶解條件下進(jìn)行酶解 （見表1），酶解完成后90℃滅酶15 min，4 000 r/min離心20 min后取上清液，凍干后得鱈魚骨膠原肽P中性、P復(fù)合、P胃和 P酸性，于-20℃儲藏備用。

表1 不同蛋白酶酶解條件Table 1 Hydrolysis conditions of different enzymes

1.3.3 抗氧化活性測定

1）鱈魚骨膠原蛋白肽對DPPH·自由基清除率的測定 DPPH·是一種穩(wěn)定的以氮為中心的質(zhì)子自由基，在517 nm波長處有最大吸收，與抗氧化劑反應(yīng)時，其孤對電子與抗氧化劑中的電子配對使其乙醇溶液由紫色褪色成黃色，褪色程度反映出抗氧化劑的活性強(qiáng)弱[9]。

測定方法參照文獻(xiàn)[10]進(jìn)行。向不同試管加入等體積不同濃度的溶劑、鱈魚骨膠原蛋白肽，混勻后25℃反應(yīng)30 min，在517 nm下測定其OD值，平行做3次取平均值。

2）對·OH自由基清除率的測定 ·OH是造成組織細(xì)胞損傷的重要活性氧之一。人體在正常的生命活動中通過新陳代謝即可以產(chǎn)生·OH，它可以引起膜過氧化、蛋白質(zhì)交聯(lián)變性、核酸損傷等，是公認(rèn)的毒性最大的自由基[11]。因此，·OH的檢測在自由基損傷研究中有著重要的意義。

測定方法參照文獻(xiàn)[12]進(jìn)行，加入鱈魚骨膠原蛋白肽后將溶液混合均勻，37℃水浴保溫30 min，在510 nm下測定其OD值，平行做3次取平均值。

3）對O2-·自由基清除率的測定 鄰苯三酚在弱堿條件下發(fā)生自氧化反應(yīng)產(chǎn)生O2-·，O2-·清除劑能使鄰苯三酚自氧化產(chǎn)物在325 nm處吸收峰受到抑制。采用光化學(xué)方法監(jiān)測，可間接測得O2-·的生成及O2-·的清除率[13]。測定方法參照文獻(xiàn)[14-15]進(jìn)行，加鱈魚骨膠原蛋白肽后將溶液混合均勻，于325 nm波長處測定其OD值，平行做3次取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 鱈魚骨膠原蛋白肽對DPPH·的清除效果

4種蛋白酶酶解鱈魚骨膠原蛋白肽對DPPH·的清除能力結(jié)果見圖1。由圖1可知，從總體上看4種蛋白酶酶解膠原蛋白肽對DPPH·的清除能力隨著樣品質(zhì)量濃度的增加而增強(qiáng)；多肽質(zhì)量濃度在2～4 mg/mL時，4種蛋白酶酶解膠原蛋白肽對DPPH·的清除能力順序為 P酸性＞P胃＞P中性=P復(fù)合； 在 6～12 mg/mL時，清除能力順序為 P酸性＞P中性＞P復(fù)合＞P胃。 4種蛋白酶酶解膠原蛋白肽對DPPH·的清除能力均明顯高于王東等[16]提取的鮭鱒魚骨膠原蛋白肽（3 mg/mL，13.33%），推測這可能與多肽的提取制備工藝和魚骨的品種有關(guān)。

圖 1 4種蛋白酶酶解鱈魚骨膠原蛋白肽對DPPH·的清除能力Fig.1 Scavenging capacities of four kinds of collagen peptides from cod bone to DPPH·free radical

2.2 鱈魚骨膠原蛋白肽對O2-·的清除效果

4種蛋白酶酶解鱈魚骨膠原蛋白肽對O2-·的清除能力見圖2。由圖可知，在受試濃度范圍內(nèi)，4種蛋白酶酶解膠原肽的清除能力均隨樣品質(zhì)量濃度增大而增強(qiáng)；中性蛋白酶和復(fù)合蛋白酶酶解膠原蛋白肽對2-·的清除能力較大，當(dāng)多肽質(zhì)量濃度為6 mg/mL時，二者對O2-·的清除能力相同；酸性蛋白酶酶解膠原蛋白肽居中；胃蛋白酶酶解膠原蛋白肽的清除能力最弱，且明顯小于其它3種蛋白酶的酶解膠原蛋白肽。

圖 2 4種蛋白酶酶解鱈魚骨膠原蛋白肽對O2-·的清除能力Fig.2 Scavenging capacities of four kinds of collagen peptides from cod bone to O2-·free radical

2.3 鱈魚骨膠原蛋白肽對·OH的清除效果

4種蛋白酶酶解鱈魚骨膠原蛋白肽對·OH的清除能力見圖3。由圖3可知，在受試質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，4種蛋白酶酶解膠原肽對·OH清除能力均隨質(zhì)量濃度的增大而增強(qiáng)，且有較好的量-效關(guān)系；清除能力順序為 P中性＞P復(fù)合＞P酸性＞P胃。 多肽質(zhì)量濃度在0.75 mg/mL至1.25 mg/mL時，中性蛋白酶和復(fù)合蛋白酶對·OH清除能力隨質(zhì)量濃度的增加而急劇增強(qiáng)。經(jīng)比較知，4種蛋白酶酶解膠原蛋白肽對·OH的清除能力與王東等[16]提取的鮭鱒魚骨膠原蛋白肽（3 mg/mL，11.24%）相比有顯著提高，其中，當(dāng)質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL時，中性蛋白酶酶解膠原蛋白肽對·OH的清除率達(dá)到14.1%。

圖3 4種蛋白酶酶解鱈魚骨膠原蛋白肽對·OH的清除能力Fig.3 Scavenging capacities of four kinds of collagen peptides from cod bone to·OH free radical

經(jīng)比較可知，盡管胃蛋白酶酶解膠原蛋白肽對·OH清除能力最弱，當(dāng)質(zhì)量濃度為1.5 mg/mL時，胃蛋白酶酶解膠原蛋白肽對·OH的清除率仍達(dá)到27.97%，均大于4種蛋白酶酶解膠原肽在質(zhì)量濃度為2 mg/mL時對DPPH·和O2-·清除率，因而4種蛋白酶酶解膠原蛋白肽對·OH的清除能力明顯優(yōu)于其它2種自由基。

2.4 蛋白酶酶解膠原蛋白肽對DPPH·和O2-·自由基的清除效果比較

比較圖4～7可知，同一種蛋白酶酶解膠原蛋白肽對DPPH·和O2-·自由基的清除能力各不相同；多肽濃度在4～10 mg/mL時，4種蛋白酶酶解膠原蛋白肽對DPPH·的清除能力均大于對O2-·自由基的清除能力。

圖4 中性蛋白酶酶解鱈魚骨膠原蛋白肽對2種自由基的清除能力Fig.4 Scavenging capacity of collagen peptide prepared by neutral protease to two kinds of free radicals

圖5 復(fù)合蛋白酶酶解鱈魚骨膠原蛋白肽對2種自由基的清除能力Fig.5 Scavenging capacity of collagen peptide prepared by protamex to two kinds of free radicals

圖6 胃蛋白酶酶解鱈魚骨膠原蛋白肽對2種自由基的清除能力Fig.6 Scavenging capacity of collagen peptide prepared by acidic protease to two kinds of free radicals

圖7 酸性蛋白酶酶解鱈魚骨膠原蛋白肽對2種自由基的清除能力Fig.7 Scavenging capacity of collagen peptide prepared by pepsin to two kinds of free radicals

3 結(jié)語

我國鱈魚年加工量（4～5）×105t[17]，在其生產(chǎn)過程中會產(chǎn)生魚骨等大量下腳料，鱈魚骨中富含膠原蛋白，蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為35.78%[1]。作者通過熱水浸提法制備鱈魚骨膠原蛋白，采用4種酶分別酶解鱈魚骨膠原蛋白制備膠原蛋白肽，并測定了其對·OH、DPPH·和O2-·3種自由基的清除效果。結(jié)果表明:中性蛋白酶、復(fù)合蛋白酶、酸性蛋白酶和胃蛋白酶酶解鱈魚骨膠原蛋白制得的膠原蛋白肽其抗氧化活性較強(qiáng)，其對3種自由基的清除能力均隨樣品質(zhì)量濃度的增大而增強(qiáng)，但不同蛋白酶酶解膠原蛋白肽對3種自由基的清除能力各不相同。因此，鱈魚骨膠原蛋白肽在功能性食品、化妝品及生物制藥等方面具有很好的應(yīng)用潛力，值得進(jìn)一步研究、開發(fā)。

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