采用差速貼壁法培養動物及人細胞研究進展

印文靜，顏海華，馮亞松，田 潔，王勝軍 (.江蘇省泰州市第四人民醫院，江蘇 泰州 5300;.江蘇大學基礎醫學與醫學技術學院，江蘇 鎮江 03)

細胞培養是現代生物醫學的重要技術之一，在細胞生物學、生物化學、臨床檢驗學等領域應用較為廣泛，成為闡釋生命現象、發病機理和篩選藥物的重要手段，已成為醫藥生物技術產業的重要部分之一［1］。差速貼壁法由Kreider和Pleasure等較早報道［2］。該方法更加便于研究者簡便探索細胞特別是胚胎干細胞誘導分化的機制，并有利于對結果進行精確、快速的檢測。因此通過單層貼壁誘導途徑進行細胞的培養、分化的研究報道越來越多［2］。本文對近年來采用差速貼壁法培養動物及人細胞的文獻進行綜述如下。

1 干細胞

胚胎干細胞是具有自我更新和多向分化能力的一類增殖旺盛的細胞，具有向機體各種組織細胞分化的潛能［3］。徐超等運用差速貼壁法分離鼠纖維母細胞(MEF)和小鼠胚胎干細胞(ES)［4］，實驗不但找到了分離MEF和ES的最佳時間(約1.5 h)，而且結果還顯示，差速貼壁后的GD3細胞仍然擁有保持其干細胞的全能性，其單克隆的形成率也和差速貼壁前的GD3細胞無顯著差異，在很大程度上為差速貼壁法在干細胞分化中的應用提供了有力的實驗證明。李甫強等運用差速貼壁法分離純化綠色熒光蛋白(GFP)轉基因小鼠骨髓間充質干細胞［5］。實驗結果顯示，隨著首次換液時間的延長，貼壁細胞密度增多，BMSCs的比例減少。首次換液時間在接種后2 h的細胞純度高，但細胞密度低;24 h后的細胞密度高而純度低;8 h后的細胞密度大具有較高的純度，傳代后的GFP轉基因小鼠BMSCs能穩定表達GFP。傅淑平等采用差速貼壁法觀察梓醇對SD大鼠骨髓間充質干細胞增殖及骨向分化的影響［6］。結果表明，梓醇具有促BMSCs增殖及骨向分化的作用。而所采用的差速貼壁法為實驗提供了較好的技術手段。劉虎仙等重復利用Ⅳ型膠原以差速貼壁法分選表皮干細胞［7］，研究表明，利用快速貼壁法可以得到較高純度的表皮干細胞，合理回收利用Ⅳ型膠原以快速貼壁法分選表皮干細胞是一種實用而經濟的方法。丁維進等運用改良的差速貼壁法分離肌源干細胞［8］，研究結果提示應用改良的差速貼壁法和有限稀釋技術可以分離得到小鼠來源肌源干細胞及其克隆集落。

袁軍等探討差速貼壁法從早期人胚股骨分離、純化骨髓間充質干細胞(BMSCs)的可行性，并觀察培養細胞是否向神經元樣細胞誘導分化［9］。研究結果表明，原代培養第3天可見塑料培養瓶內有長梭形細胞生長，至第10天前后形成集落樣克隆，傳至第4代后呈單層漩渦狀排列的長梭形的成纖維樣細胞，已無明顯細胞克隆形成，經多次傳代，細胞保持良好的增殖能力和穩定的性狀;免疫細胞化學方法顯示未誘導細胞神經元烯醇化酶、神經巢蛋白、膠質纖維酸性蛋白陰性，誘導后細胞神經元烯醇化酶、神經巢蛋白呈陽性，膠質纖維酸性蛋白陰性，間接證實培養所得細胞是BMSCs。他們認為差速貼壁培養法從早期人胚股骨中分離純化BMSCs，去除可能的成纖維細胞污染，是簡便有效的，可供有關研究參考選擇。

2 嗅黏膜嗅鞘細胞

田鋒等采用經改良的取材和差速貼壁法培養純化嗅SD大鼠黏膜嗅鞘細胞(OECs)［10］，以探求更加簡單、高效的嗅黏膜OECs取材和培養純化方法。實驗結果表明，體外培養的嗅黏膜OECs形態主要有扁圓形或油煎蛋形、梭形或雙極、多突起形，培養14 d嗅黏膜OECs純度為85%，嗅黏膜OECs最長可以存活35 d。研究認為，采用改良的取材和差速貼壁法培養、純化的嗅黏膜OECs，方法簡單、高效，培養的嗅黏膜OECs的純度可以達到細胞移植的要求。李玉安等探討單次差速貼壁法純化培養成年大鼠嗅球嗅鞘細胞的可行性，實驗通過18 h單次差速貼壁法純化培養的嗅鞘細胞經NGFRp75免疫熒光鑒定后，純度可達70% ～80%，形態上以雙極和三極細胞為主，伴有少許單極及多極細胞［11］。研究結果表明，應用18 h單次差速貼壁法純化培養嗅鞘細胞是一種簡便、穩定、經濟、快捷的方法。

王斌等采用不同純化方法原代培養人胚嗅球嗅鞘細胞(OECs)［12］，以差速貼壁法為基礎結合阿糖胞苷法、無血清饑餓法和間斷神經營養因子3(NT3)法純化培養人胚嗅球OECs，觀察不同純化方法下OECs生長變化，采用免疫細胞化學染色進行純度鑒定。實驗結果表明，差速貼壁結合間斷NT3法可獲得高純度狀態良好的OECs，是一種簡單實用的OECs純化培養方法。

3 內皮祖細胞

李辰運等采用密度梯度離心法分離培養大鼠骨髓血管內皮祖細胞［13］，于包被人纖連蛋白的25 ml培養瓶中貼壁培養，收集48 h后的未貼壁細胞培養至第7天，實驗結果顯示，差速貼壁法是獲得穩定、高純度的內皮祖細胞培養方法。

李建輝等利用免疫組化、免疫熒光及流式細胞術對培養的人臍血內皮祖細胞進行鑒定，建立一種內皮祖細胞的培養方法［14］，研究也同樣表明，差速貼壁法培養內皮祖細胞的經濟、可靠、穩定。

4 其他細胞

陳振兵等采用Ⅺ型膠原酶和胰蛋白酶消化法及差速貼壁法分離細胞獲取小鼠肌源性干細胞，進行體外原代和傳代培養［15］。實驗結果顯示，采用差速貼壁法可從失神經骨骼肌內分離出肌源性干細胞，體外培養的肌源性干細胞具有良好的增殖能力，適用于組織工程和基因治療。孫浩林等采用胰蛋白酶、Ⅱ型膠原酶先后消化Wistar大鼠椎間盤髓核組織，差速貼壁法分離純化大鼠腰椎間盤髓核細胞［16］。研究結果表明，原代培養、兩次差速貼壁法分離純化的大鼠髓核細胞代謝旺盛、表型一致。張群等將人毛囊外根鞘細胞(HHORSC)接種在Ⅸ型膠原涂被的培養皿上進行黏附分選，試驗組細胞和對照組細胞分別進行K15、β1-整合素、外皮蛋白免疫熒光和流式細胞術檢測細胞超微結構并測定克隆形成率［17］。研究結果表明試驗組 K15和β1-整合素的表達分別為(70.1±6.7)% 和(82.4±9.3)%，對照組相應為(32.1±8.9)% 和(30.3±1.3)%，外皮蛋白兩組間的表達為(26.7±8.6)%和(79.2±15.3)%，兩組間差異有統計學意義(P＜0.05)。研究認為差速貼壁法可初步分選、純化人毛囊干細胞。

采用差速貼壁法進行細胞培養具有經濟、可靠、速度快、不用抗有絲分裂藥物抗血清和補體等優點，在動物及人組織細胞的培養上具有廣泛用途。但由于該方法本身的缺陷，成纖維細胞含量高于其他方法，在使用該方法培養細胞時需多加注意。但我們相信該方法將在以后的應用會越來越廣泛。

［1］ 李 常，葛正行，李 波.大鼠氣道成纖維細胞的分離、培養及鑒定［J］. 吉林醫學，2012，33(19):4043.

［2］ Kreider B Q，Messing A，Doan H，et al.Enrichment of schwann cell cultures from neonatal rat sciatic nerve by differential adhesion［J］.Brain Res，1981，207(2):433.

［3］ 胡一新，黃 璟.小鼠胚胎干細胞飼養層的制備［J］.吉林醫學，2009，30(9):778.

［4］ 徐 超，黃華榮，俞 宏，等.分離MEF和ES細胞的差速貼壁法研究［J］.分子細胞生物學報，2006，39(5):477.

［5］ 李甫強，周鴻鷹，羊惠君，等.差速貼壁法純化分離GFP轉基因小鼠骨髓間充質干細胞［J］.四川大學學報(醫學版)，2006，37(2):301.

［6］ 傅淑平，張榮華.不同濃度梓醇對SD大鼠骨髓間充質干細胞增殖及骨向分化的影響［J］.時珍國醫國藥，2012，23(10):2398.

［7］ 劉虎仙，賈赤宇，付小兵，等.重復利用IV型膠原以差速貼壁法分選表皮干細胞［J］.中國臨床康復，2006，10(13):38.

［8］ 丁維進，唐 乙，宋艷玲，等.應用改良差速貼壁法和有限稀釋技術分離培養小鼠來源肌源干細胞［J］.中國組織工程研究與臨床康復，2011，15(36):6797.

［9］ 袁 軍，單立冬，楊天明，等.差速貼壁法分離培養早期人胚骨髓間充質干細胞［J］.東南大學學報(醫學版)，2005，24(4):218.

［10］ 田 鋒，姜曙祥，賀西京，等.經改良的取材和差速貼壁法培養純化嗅黏膜嗅鞘細胞［J］.細胞與分子免疫學雜志，2009，25(12):1189.

［11］ 李玉安，徐華梓，李萬里.單次差速貼壁法純化培養大鼠嗅神經鞘細胞的實驗研究［J］.實用醫學雜志，2009，25(10):1562.

［12］ 王 斌，賀西京，歷 強，等.不同純化方法體外培養人胚嗅球嗅鞘細胞［J］.四川大學學報(醫學版)，2008，39(6):1023.

［13］ 李辰運，陳劍秋，孫晉津，等.差速貼壁法培養大鼠骨髓內皮祖細胞的實驗研究［J］.天津醫藥，2011，39(4):353.

［14］ 李建輝，初少莉，姬開達，等.差速貼壁法體外培養人臍血內皮祖細胞的實驗研究［J］.中華高血壓雜志，2005，16(5):450.

［15］ 陳振兵，洪光祥，陳燕花，等.差速貼壁法體外培養失神經骨骼肌肌源性干細胞的生物學特性［J］.中國臨床康復，2006，10(33):7.

［16］ 孫浩林，李淳德.原代培養差速貼壁法分離純化大鼠腰椎間盤髓核細胞［J］.中國組織工程研究與臨床康復，2011，15(46):8569.

［17］ 張 群，楊光輝，叢 笑，等.差速貼壁法分選人毛囊干細胞的研究［J］.中華實驗外科學雜志，2006，23(6):755.