5-Aza-dc對宮頸癌細胞系FAM9C基因表達及甲基化影響

于嘯,張婷,楊晨曦,王言奎

(青島大學醫學院附屬醫院婦產科,山東青島 266003)

5-Aza-dc對宮頸癌細胞系FAM9C基因表達及甲基化影響

于嘯,張婷,楊晨曦,王言奎

(青島大學醫學院附屬醫院婦產科,山東青島 266003)

目的探討甲基轉移酶抑制劑5-氮雜-2’脫氧胞苷(5-Aza-dc)對宮頸癌細胞系抑癌基因FAM9C表達及甲基化狀態的影響。方法常規培養高危型人乳頭瘤病毒(HPV)陽性宮頸癌細胞系HeLa、Caski和HPV陰性宮頸癌細胞系HT-3、C-33A,分別用5、10、15μmol/L的5-Aza-dc作用3、5、7 d,實時熒光定量PCR(qRT-PCR)方法檢測FAM9C基因表達,甲基化特異性PCR(MSP)方法檢測基因啟動子區甲基化狀態。結果未經5-Aza-dc處理的HPV陽性宮頸癌細胞系FAM9C基因呈低表達,基因啟動子區表現為完全甲基化狀態;未經5-Aza-dc處理的HPV陰性宮頸癌細胞系FAM9C基因表達水平較高,基因啟動子區呈不完全甲基化和非甲基化狀態。10或15μmol/L的5-Aza-dc作用5 d時,HPV陽性宮頸癌細胞系HeLa、Caski的FAM9C基因表達顯著上調,基因啟動子區由完全甲基化轉變為不完全甲基化和非甲基化狀態;HPV陰性宮頸癌細胞系HT-3、C-33A應用5-Aza-dc處理前后FAM9C基因表達及啟動子區甲基化狀態無明顯變化。結論HPV誘導異常甲基化可能是宮頸癌細胞系FAM9C基因表達降低甚至沉默的主要原因;甲基轉移酶抑制劑5-Aza-dc能逆轉FAM9C基因甲基化狀態,使該基因重新表達。

宮頸腫瘤;人乳頭瘤病毒;DNA甲基化;5-氮雜-2’脫氧胞苷

DNA甲基化是目前表觀遺傳學研究的熱點,基因突變、染色體物質缺失以及基因啟動子區異常甲基化被認為是抑癌基因功能失活的重要機制。高危型人乳頭瘤病毒(HPV)持續感染被認為是導致宮頸上皮內瘤變(CIN)及宮頸癌發生的重要原因[1]。HPV通過誘導抑癌基因異常甲基化而導致其功能失活可能是HPV致癌機制之一[2-3]。5-氮雜-2’脫氧胞苷(5-Aza-dc)是一種類核苷甲基轉移酶抑制劑,可與DNA甲基轉移酶共價結合抑制其活性,逆轉基因甲基化狀態,使因甲基化而沉默基因重新表達。本課題組前期研究自宮頸癌細胞系篩選出可能因HPV誘導高甲基化而沉默的抑癌基因FAM9C,該基因編碼的蛋白與細胞核定位信號相關,其表達缺失與染色體異常有關。本實驗探討了5-Aza-dc對FAM9C基因表達以及甲基化狀態的影響,旨在為5-Aza-dc有效逆轉宮頸癌細胞系基因甲基化狀態尋找最佳作用濃度和時間提供實驗依據。

1 材料和方法

1.1 材料

HPV18陽性宮頸癌細胞系HeLa及HPV陰性宮頸癌細胞系HT-3,由青島大學醫學院微生物學實驗室保存;HPV16陽性宮頸癌細胞系Caski,購自中國醫學科學院腫瘤研究所;HPV陰性宮頸癌細胞系C-33A,購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。DMEM培養液、TRIzol和胎牛血清均購自GIBCO公司;D-Hanks粉劑購自Hyclone公司;5-Aza-dc、氫醌和亞硫酸氫鈉購自Sigma公司。RNeasy Mini試劑盒、Quantifast SYBR Green PCR試劑盒和QIAEXⅡDNA回收試劑盒均購自QIAGEN公司;Revert Aid第一鏈cDNA合成試劑盒購自Fermentas公司;HotStart TaqDNA聚合酶等PCR相關試劑購自Ta KaRa公司;飽和酚、氯仿及無水乙醇等均為國產試劑;引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.2 細胞培養及藥物處理

用含體積分數0.10胎牛血清、100 k U/L青霉素和200 mg/L鏈霉素的DMEM培養基,于37℃、含體積分數0.05的CO2培養箱中培養HeLa、Caski、HT-3和C-33A細胞系。取對數生長期的上述4種細胞接種至75 cm2細胞培養瓶,細胞貼壁后分別加入5、10、15μmol/L的5-Aza-dc,分別作用3、5、7 d,每24 h換含相同濃度藥物的培養液1次。以未經5-Aza-dc處理的細胞系作為對照組。5-Aza-dc作用結束后胰蛋白酶消化單層細胞,D-Hanks液洗細胞2次,離心收集細胞沉淀。

1.3 核酸提取及DNA亞硫酸氫鹽修飾

酚-氯仿-異戊醇法常規提取細胞DNA,超純水溶解,紫外線分光光度法測定各樣品DNA濃度。取5μg細胞DNA,加3.3μL新鮮配制的3 mol/L NaOH溶液混勻變性,37℃水浴15 min,加333μL新鮮配制的亞硫酸氫鹽溶液(2.4 mol/L亞硫酸氫鈉,3 mol/L NaOH和10 mmol/L氫醌的混合液), 55℃避光孵育4 h進行DNA亞硫酸氫鹽修飾。采用DNA回收試劑盒對修飾后的DNA進行脫鹽純化處理。將處理后DNA溶于50μL TE溶液中,室溫靜置5 min,加入3 mol/L NaOH 5.56μL,37℃水浴15 min,使其脫磺化基團。再加入9 mol/L NH4OAC(p H 7.0)27.78μL,3 mol/L NaOAC (p H 5.2)50μL,采用DNA回收試劑盒再次回收純化,將純化后的DNA溶解于100μL TE溶液中,置－20℃保存,用于甲基化特異性PCR(MSP)檢測。

1.4 FAM9C基因表達檢測

采用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)方法。使用TRIzol一步法提取細胞總RNA,RNeasy Mini試劑盒純化,參照逆轉錄試劑盒說明書逆轉錄合成cDNA作為PCR模板,－20℃保存,1周內使用。采用qRT-PCR方法分別檢測He La、Caski、HT-3和C-33A細胞系在不同5-Aza-dc濃度和時間作用下FAM9C基因表達水平,以未經5-Aza-dc處理的細胞系為對照組,并設立空白對照。應用Prime premier 5軟件設計特異性引物,FAM9C基因上游引物序列為:5′-CAAGGACCAGTTGGAGGTTC-3′,下游引物序列為:5′-TACTGGATCCTTTCCTGCAA-3′,應用羅氏Light Cycler 480Ⅱ熒光定量PCR儀進行擴增和數據分析。qRT-PCR反應體系為20μL,包括:2×Quantifast SYBR Green PCR混合液10μL,上、下游引物0.5μmol/L,無RNase水6μL,模板cDNA 2μL。反應條件為:95℃預變性15 min;94℃變性15 s,55℃退火30 s,72℃延伸30 s,共循環40次;每次循環結束后進行熒光檢測;同時擴增GAPDH作為內參照基因。擴增結束后, 95℃1 min,55℃30 s后逐步升溫至95℃進行融解曲線分析,確定擴增產物的特異性。測定各樣本反應管內熒光信號達到設定閾值時所經歷的循環數(Ct),每個樣品均重復檢測3次,取其Ct均值。采用2－△△Ct相對定量法[4]分析目的基因在各組細胞中表達差異,其中△Ct＝目的基因Ct－內參照基因Ct,△△Ct＝處理組△Ct－對照組△Ct。

1.5 FAM9C基因啟動子區甲基化狀態檢測

采用MSP方法,檢測He La、Caski、HT-3和C-33A細胞系在5-Aza-dc不同濃度和時間作用下FAM9C基因啟動子區甲基化狀態,以未經5-Azadc處理的細胞系為對照組,并設立陰性對照。應用Methprimer軟件設計甲基化特異性引物(M),上游引物序列為:5′-TTTATGTCGTTCGTTATTTGTATGC-3′,下游引物序列為:5′-AACCTAAATCCTCTATTCTCACGAA-3′,產物長103 bp;非甲基化特異性引物(U),上游引物序列為:5′-ATGTTGTTTGTTATTTGTATGTGT-3′,下游引物序列為:5′-AACCTAAATCCTCTATTCTCACAAA-3′,產物長100 bp。MSP反應體系25μL,包括:亞硫酸氫鹽修飾的DNA模板2μL,熱啟動DNA聚合酶1 U,1.5 mmol/L MgCl2,0.2 nmol/L d NTP和0.6 mmol/L引物。MSP反應條件為:95℃預變性5 min;95℃變性30 s,60℃退火30 s,72℃延伸1 min,共循環35次;最后72℃延伸10 min。擴增產物行20 g/L瓊脂糖凝膠電泳,紫外線凝膠成像系統觀察結果。

1.6 統計學方法

應用SPSS 17.0軟件進行統計學分析,FAM9C基因各時間、濃度組間表達差異比較采用析因設計方差分析,組間比較采用LSD法,P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 5-Aza-dc不同濃度、不同作用時間對宮頸癌細胞系FAM9C基因表達影響

融解曲線分析顯示,qRT-PCR基因擴增產物呈單峰,為特異性擴增,空白對照無擴增。未經5-Azadc處理的對照組HPV陽性宮頸癌細胞系He La和Caski細胞系FAM9C基因均呈低表達;不同濃度5-Aza-dc作用不同時間后其表達均有不同程度的上調,其中10μmol/L 5-Aza-dc作用5 d組He La細胞系FAM9C基因表達上調最為明顯,差異有顯著性(F＝4.044,P＜0.05);15μmol/L 5-Aza-dc作用5 d時Caski細胞系FAM9C基因表達上調最為顯著,差異有顯著意義(F＝5.486、4.022,P＜0.05)。HPV陰性宮頸癌細胞系HT-3和C-33A細胞5-Aza-dc作用前后,FAM9C基因表達差異無顯著性(P＞0.05)。見表1。

2.2 FAM9C基因啟動子區甲基化狀態

未經5-Aza-dc處理的對照組He La和Caski細胞系FAM9C基因只有甲基化特異性引物(M)擴增出條帶,其基因啟動子區表現為完全甲基化狀態; HPV陰性宮頸癌細胞HT-3甲基化特異性引物和非甲基化特異性引物均擴增出條帶(M＋U),基因啟動子區為不完全甲基化狀態;C-33A細胞系僅非甲基化特異性引物擴增出條帶(U),基因啟動子區為非甲基化狀態。5-Aza-dc處理后,HeLa和Caski細胞系FAM9C基因啟動子區甲基化程度降低,由完全甲基化轉變為不完全甲基化和非甲基化狀態; HPV陰性宮頸癌細胞系5-Aza-dc作用前后甲基化狀態無明顯改變(圖1)。

3 討 論

腫瘤發生多伴隨抑癌基因的功能減弱或沉默,抑癌基因啟動子區異常甲基化被認為是除突變和缺失以外抑癌基因功能失活的關鍵機制,與基因表達沉默有一定相關性[5-7]。約90%的宮頸癌組織中可以檢測到HPV存在,而HPV感染通過表觀遺傳學機制誘導宿主細胞抑癌基因高甲基化,導致抑癌基因表達沉默,可能是HPV促進宮頸癌發生發展的機制之一[8-9]。以5-Aza-dc為代表的類核苷甲基轉移酶抑制劑,通過與DNA甲基轉移酶共價結合抑制其活性,降低基因甲基化水平,已廣泛應用于逆轉腫瘤細胞的異常甲基化,誘導由于甲基化而沉默的腫瘤抑制基因重新表達,抑制腫瘤細胞生長,從而達到殺傷腫瘤細胞的效應。5-Aza-dc這種逆轉基因甲基化水平的作用,為研究甲基化對基因表達的影響提供實驗基礎。

表1 不同濃度5-Aza-dc作用不同時間宮頸癌細胞系FAM9C基因相對表達量比較±s)

時間(t/d)濃度(c/ μmol·L－1)HeLa Caski HT-3 C-33A 3 5 1.738±0.405 1.384±0.283 1.131±0.051 1.080±0.085 10 2.451±0.392 1.455±0.062 0.853±0.175 0.867±0.068 15 2.368±0.437 1.734±0.203 0.883±0.030 0.917±0.075 5 5 1.985±0.215 1.562±0.205 0.859±0.062 1.128±0.112 10 2.186±0.532 1.801±0.152 1.041±0.038 1.636±0.263 15 1.746±0.418 1.992±0.246 0.630±0.211 0.998±0.096 7 5 1.304±0.190 1.263±0.128 0.676±0.141 1.786±0.112 10 2.345±0.361 1.451±0.201 0.939±0.049 0.663±0.091 _________15___1.981±0.493 1.651±0.248 0.769±0.07____________ 4 1.039±0.085

我們前期研究應用基因芯片技術自宮頸癌細胞系篩選出可能由HPV誘導高甲基化而沉默的抑癌基因FAM9C,該基因位于Xp22.2,其編碼蛋白與細胞核定位信號相關。有研究認為,FAM9C表達缺失與染色體異常有關,但具體功能尚未明確[10]。本研究通過應用不同濃度5-Aza-dc作用不同時間處理HPV陽性宮頸癌細胞系He La、Caski和HPV陰性宮頸癌細胞系HT-3、C-33A,探討5-Aza-dc作用對FAM9C基因表達以及甲基化狀態的影響。結果顯示,未經5-Aza-dc處理的HPV陽性He La和Caski宮頸癌細胞系FAM9C基因均呈低表達,不同濃度5-Aza-dc作用不同時間后該基因均有不同程度的表達上調;5-Aza-dc處理He La和Caski細胞系可降低FAM9C基因啟動子區甲基化狀態,變為不完全甲基化狀態,該基因表達與啟動子區甲基化狀態存在負相關關系;5-Aza-dc作用HPV陰性宮頸癌細胞系HT-3和C-33A細胞前后,FAM9C基因表達及啟動子區甲基化狀態均無明顯變化,提示FAM9C基因的沉默可能與HPV作用有關,HPV可能誘導該基因的高甲基化。5-Aza-dc作用可逆轉HPV陽性He La和Caski宮頸癌細胞系FAM9C基因的甲基化狀態,誘導該基因的表達水平升高,其中以10、15μmol/L濃度組作用5 d效果較為明顯。

綜上所述,5-Aza-dc可逆轉基因甲基化狀態,使基因重新表達,不同濃度5-Aza-dc作用不同時間后對基因表達影響不同。通過對5-Aza-dc影響宮頸癌細胞FAM9C基因表達及甲基化狀態的分析,可為5-Aza-dc處理宮頸癌細胞系逆轉基因甲基化狀態尋找最佳作用濃度和作用時間提供實驗依據。對HPV相關腫瘤表觀遺傳學的深入研究有助于闡明HPV在宿主細胞基因甲基化發生中的作用機制。

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(本文編輯 黃建鄉)

EFFECT OF 5-Aza-dc-2’-DEOXYCYTIDINE ON THE EXPRESSION AND METHYLATION OF FAM9C GENE IN CERVICAL CANCER CELL LINES

YU Xiao,ZHANG Ting,YANG Chenxi,WANG Yankui (Department of Obstetrics and Gynecology, The Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College,Qingdao 266003,China)

ObjectiveTo investigate the effect of 5-Aza-dc-2’-deoxycytidine(5-Aza-dc)on the expression and methylation of FAM9C gene.MethodsHPV-positive cervical cancer cells(He La and Caski)and HPV-negative cervical cancer cells(C-33A and HT-3)were cultured with different doses of 5-Aza-dc(5,10 and 15μmol/L)for different time,3 days,5 days and 7 days,respectively.Gene expression was detected by using fluorescent quantitative real-time PCR and methylation status of gene promoters by methylation-specific PCR.ResultsIn HPV-positive cervical cancer cell line that not yet treated with 5-Aza-dc, FAM9C gene showed low expression and its promoters were completely methylated;in HPV-negative that not yet treated with 5-Aza-dc,the expression of FAM9C was higher,and incompletely methylated or non-methylated promoters were observed.The expression of FAM9C gene in HPV-positive cervical cancer cells significantly increased with 10 or 15μmol/L 5-Aza-dc treatment for 5 days.Gene promoters reversed to incompletely methylated or non-methylated from complete methylation.The expression and methylation status of FAM9C gene were not significantly changed in HPV-negative cervical cancer cells－before and after treatment with HT-3,C-33A and 5-Aza-dc.ConclusionHPV-induced abnormal methylation is probably a main cause of decreased expression or even silent of FAM9C gene;methyltransferase inhibitor 5-Aza-dc can invert the methylation status of the gene and make it to re-express.

uterine cervical neoplasms;human papillomavirus;DNA methylation;5-Aza-dc-2’-deoxycytidine

R711

A

1008-0341(2013)04-0292-04

10.11712/qlyx201304004

2013-02-26;

2013-06-03

國家自然科學基金資助項目(No.81172480)

于嘯(1986-),女,在讀碩士研究生。

王言奎(1960-),男,碩士,教授,博士生導師。