白三烯C4合成酶基因多態(tài)性與缺血性腦卒中關(guān)系

孫瑛,李海先,吳海容,侯樹剛,周暢,張晨

(青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,山東青島 266003)

白三烯C4合成酶基因多態(tài)性與缺血性腦卒中關(guān)系

孫瑛,李海先,吳海容,侯樹剛,周暢,張晨

(青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,山東青島 266003)

目的探討白三烯C4(LTC4)合成酶基因啟動(dòng)子區(qū)rs730012(-444A/C)位點(diǎn)多態(tài)性與缺血性腦卒中(IS)的相關(guān)性。方法應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(PCR-RFLP)及凝膠電泳技術(shù),檢測(cè)IS組和與其性別及年齡相匹配的健康對(duì)照組LTC4合成酶基因啟動(dòng)子區(qū)rs730012位點(diǎn)多態(tài)性,并比較兩組基因型、等位基因頻率的差異。采用Logistic回歸去除傳統(tǒng)危險(xiǎn)因素的影響,分析其基因型、等位基因頻率與IS發(fā)病相關(guān)性。結(jié)果IS組rs730012位點(diǎn)非攜帶C等位基因(AA基因型)人群患IS的風(fēng)險(xiǎn)約是攜帶C等位基因(AC＋CC基因型)人群的1.6倍(OR＝1.636,P＜0.05)。結(jié)論LTC4合成酶基因rs730012位點(diǎn)多態(tài)性可能與IS發(fā)病相關(guān),等位基因A可能是其風(fēng)險(xiǎn)等位基因。

白三烯C4;腦血管意外;多態(tài)性,單核苷酸

腦卒中是嚴(yán)重危害人類健康的疾病,會(huì)造成嚴(yán)重殘疾。缺血性腦卒中(IS)約占卒中的70%,是臨床上最常見(jiàn)的腦卒中類型。IS的病理學(xué)基礎(chǔ)為動(dòng)脈粥樣硬化。研究表明,白三烯(LTs)與動(dòng)脈粥樣硬化有關(guān),并能增加心血管疾病患病率[1]。LTs通過(guò)花生四烯酸(AA)經(jīng)氧化代謝途徑形成。磷脂膜釋放AA,經(jīng)過(guò)氧化、脫水生成白三烯A4(LTA4)。LTA4能轉(zhuǎn)化為白三烯B4(LTB4)或有血管收縮、致炎作用的半胱氨酸白三烯(Cys LTs),后者包括白三烯C4(LTC4)、白三烯D4(LTD4)和白三烯E4 (LTE4)。Cys LTs不僅廣泛參與多種炎癥病理過(guò)程,而且參與腦卒中、腦外傷等中樞神經(jīng)系統(tǒng)的病理過(guò)程。LTC4合成酶是LTs合成Cys LTs通路的一種關(guān)鍵酶。研究表明,女性LTC4合成酶啟動(dòng)子區(qū)的-444A/C易位與冠狀動(dòng)脈鈣水平升高和平均頸動(dòng)脈內(nèi)膜中層厚度增加有關(guān)[2]。目前就LTC4合成酶啟動(dòng)子區(qū)基因多態(tài)性與IS的相關(guān)性國(guó)外研究較少,且缺乏大規(guī)模研究,而國(guó)內(nèi)尚未有中國(guó)人群的大規(guī)模病例-對(duì)照研究。因此,有必要對(duì)LTC4合成酶與IS相關(guān)性進(jìn)行進(jìn)一步探討。本研究對(duì)LTC4合成酶基因啟動(dòng)子區(qū)的rs730012(-444A/C)位點(diǎn)多態(tài)性進(jìn)行檢測(cè),旨在探討該基因多態(tài)性與IS的相關(guān)性。現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 對(duì)象和方法

1.1 研究對(duì)象

IS組選自2010年10月—2012年5月我院神經(jīng)內(nèi)科住院的病人,共376例,男247例,女129例;平均發(fā)病年齡為(65.45±9.01)歲。納入標(biāo)準(zhǔn):①符合1995年中華醫(yī)學(xué)會(huì)第四屆腦血管會(huì)議修訂的各類腦血管疾病診斷要點(diǎn),經(jīng)嚴(yán)格的神經(jīng)系統(tǒng)體格檢查及顱腦CT或MRI掃描確診;②符合文獻(xiàn)[3]中TOAST分型,其中大動(dòng)脈粥樣硬化性腦卒中(LAA型)315例,小動(dòng)脈閉塞性腦卒中(SVD型)61例。排除標(biāo)準(zhǔn):腦出血、蛛網(wǎng)膜下隙出血、血管炎性疾病、血液病、藥物、惡性腫瘤、血管畸形等引起的腦梗死。對(duì)照組為同期我院體檢中心查體的健康人,共297例,其中男192例,女105例;平均年齡(64.9±8.55)歲;其性別、年齡等與IS組匹配,經(jīng)詳細(xì)的病史詢問(wèn)及系統(tǒng)的體格檢查后,排除心腦血管病史及神經(jīng)系統(tǒng)癥狀,確認(rèn)為正常健康人。所有研究對(duì)象均有完整的臨床資料并簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 DNA的提取 采集受檢者清晨空腹靜脈血3 m L,置于EDTA抗凝管中,應(yīng)用Promega公司全基因組DNA提取試劑盒提取DNA,并用核酸分析儀測(cè)定DNA濃度。

1.2.2 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)LTC4合成酶基因啟動(dòng)子rs730012位點(diǎn)多態(tài)性和已知的DNA序列,參考文獻(xiàn)設(shè)計(jì)PCR引物。上游引物5′-TGCGGGGCAGAAAGACAC-3′,下游引物5′-TGCTGCACCACCCCACTT-3′。

1.2.3 PCR反應(yīng)條件 DNA模板1μL,Taq PCR Master Mix 5μL,上、下游引物各0.2μL,滅菌蒸餾水3.6μL,共10μL。反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性5 min; 94℃變性45 s,58℃退火45 s,72℃延伸45 s,共35個(gè)循環(huán);最后72℃延伸10 min。

1.2.4 酶切反應(yīng) PCR產(chǎn)物用MspI限制性內(nèi)切酶消化。酶切反應(yīng)體系:MspI限制性內(nèi)切酶0.3μL, Buffer 1μL,PCR產(chǎn)物3μL,滅菌蒸餾水5.7μL,共10μL。置于37℃溫箱內(nèi)14 h進(jìn)行酶切反應(yīng)。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)40 g/L的瓊脂糖凝膠電泳鑒定基因型。取部分樣本測(cè)序以確定酶切結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料比較采用獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn),計(jì)數(shù)資料比較采用卡方檢驗(yàn),P＜0.05為差異有顯著性。應(yīng)用多因素Logistic回歸分析計(jì)算OR值及95% CI。所研究位點(diǎn)的基因型分布經(jīng)分析符合Hardy-Weinberg平衡,具有群體代表性。

2 結(jié) 果

2.1 酶切結(jié)果判定

樣品經(jīng)PCR擴(kuò)增,限制性內(nèi)切酶切割后電泳,產(chǎn)生AA、AC、CC等3種基因型。見(jiàn)圖1。

2.2 兩組基因型及等位基因頻率比較

兩組rs730012位點(diǎn)基因型分布差異有顯著性(χ2＝9.361,P＜0.05)。IS組AA基因型分布頻率顯著高于對(duì)照組(χ2＝4.293,P＜0.05)。IS組A等位基因頻率明顯高于對(duì)照組,C等位基因頻率明顯低于對(duì)照組(χ2＝7.491、7.491,P＜0.05)。LAA型病人基因型分布與對(duì)照組相比差異具有顯著意義(χ2＝9.092,P＜0.05),A等位基因頻率顯著高于對(duì)照組,C等位基因頻率顯著低于對(duì)照組(χ2＝8.117、8.117,P＜0.05);SVD型病人基因型及等位基因分布與對(duì)照組相比差異無(wú)顯著性。見(jiàn)表1。

2.4 多因素Logistic回歸分析

經(jīng)多因素Logistic回歸分析,在去除吸煙、高血壓、糖尿病、HDL的影響之后,rs730012位點(diǎn)非攜帶C等位基因(AA基因型)人群患IS的風(fēng)險(xiǎn)約是攜帶C等位基因(AC＋CC基因型)人群的1.6倍(OR＝1.636,P＜0.05)。LAA型rs730012位點(diǎn)非攜帶C等位基因人群患IS的風(fēng)險(xiǎn)約是攜帶C等位基因人群的1.7倍(OR＝1.748,P＜0.05)。見(jiàn)表2。

3 討 論

LTs有很強(qiáng)生物學(xué)活性,廣泛參與多種炎癥性病理過(guò)程。近年來(lái),5-脂氧合酶-LT途徑在動(dòng)脈粥樣硬化過(guò)程中的作用已受到重視[4],該途徑引起的炎癥反應(yīng)在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展中起重要作用。通過(guò)LT途徑的AA代謝起始于免疫、變態(tài)反應(yīng)或者炎癥刺激,5-脂氧合酶激活蛋白(FLAP)選擇性運(yùn)輸AA并促進(jìn)其經(jīng)氧化、脫水作用生成LTA4。LTC4是LTC4合成酶催化LTA4與谷胱甘肽結(jié)合的產(chǎn)物,經(jīng)轉(zhuǎn)化形成LTD4和LTE4。LTC4與LTD4、LTE4統(tǒng)稱為Cys LTs。Cys LTs可改變內(nèi)皮細(xì)胞通透性,促進(jìn)白細(xì)胞在動(dòng)脈壁聚集,導(dǎo)致血管重塑以及血栓形成。大鼠局灶性腦缺血后Cys LTs含量迅速增加,FLAP抑制劑可以抑制Cys LTs釋放,從而減少腦梗死體積[5]。因此,Cys LTs被認(rèn)為參與了某些炎癥反應(yīng)及中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的病理進(jìn)程。

LTC4合成酶是LTs合成Cys LTs通路的一種關(guān)鍵酶。LTC4合成酶基因位于人類第5號(hào)染色體(5q35)上,該基因包括5個(gè)外顯子及6個(gè)內(nèi)含子。SANAK等[6]在LTC4合成酶基因的啟動(dòng)子區(qū)發(fā)現(xiàn)了一個(gè)單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點(diǎn)-444A/C,該位點(diǎn)可能增加人群阿司匹林不耐受性哮喘的患病率。BEVAN等[7]檢測(cè)了LT合成途徑和受體的基因變異與IS及亞型的關(guān)系,結(jié)果顯示LTC4合成酶基因(rs730012)變異可使小血管性卒中的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加1.5倍。FREIBERG等[8]認(rèn)為,LTC4合成酶SNP位點(diǎn)CC基因型可減少腦血管病的患病風(fēng)險(xiǎn)。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)IS組和對(duì)照組受試者LTC4合成酶基因啟動(dòng)子區(qū)rs730012位點(diǎn)基因型及等位基因的比較,發(fā)現(xiàn)其差異均有顯著性。LTC4合成酶基因啟動(dòng)子區(qū)rs730012(-444A/C)基因多態(tài)性與IS的發(fā)生相關(guān)。與對(duì)照組相比,IS組AA基因型及A等位基因的頻率明顯增高,攜帶AA基因型的人群IS發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增高。應(yīng)用Logistic回歸分析去除影響因素后,其差異仍有顯著性,尤其在LAA型病人中。而在SVD型病人中并無(wú)明顯差異。本結(jié)果提示,A等位基因增加IS的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn),而C等位基因可能在IS的發(fā)病過(guò)程中起保護(hù)作用。其確切機(jī)制尚不明確。既往研究顯示,rs730012位點(diǎn)參與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)過(guò)程[9],結(jié)合本研究結(jié)果,提示A等位基因可能促進(jìn)了LTC4的高表達(dá),使細(xì)胞產(chǎn)生較多Cys LTs,短期內(nèi)引起血管平滑肌內(nèi)膜及中膜增殖,從而促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的形成[10];同時(shí),過(guò)量的LTC4會(huì)增強(qiáng)血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附,加重動(dòng)脈粥樣硬化的炎癥反應(yīng),導(dǎo)致管腔狹窄、斑塊不穩(wěn)定,最終發(fā)生IS并促使其進(jìn)展[11]。但本文的研究結(jié)果與BEVAN等[7]的結(jié)果并不完全一致,其原因可能是種族、地域和實(shí)驗(yàn)樣本選擇等因素存在差異。此外,由于條件限制,沒(méi)有測(cè)定研究人群血中LTs濃度,如能對(duì)血中LTs濃度進(jìn)行測(cè)定,會(huì)更好地理解該基因位點(diǎn)變異參與IS發(fā)病的機(jī)制,該問(wèn)題有待于今后進(jìn)一步研究。

綜上所述,本研究LTC4合成酶基因啟動(dòng)子區(qū)rs730012位點(diǎn)基因多態(tài)與IS有相關(guān)性,其A等位基因可能增加患IS的風(fēng)險(xiǎn),而等位基因C可能是IS發(fā)病的保護(hù)性因素,但其確切機(jī)制尚不明確,有待于進(jìn)一步研究。

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(本文編輯 厲建強(qiáng))

ASSOCIATION BETWEEN LEUKOTRIENE C4 GENE POLYMORPHISMS AND CEREBRAL ISCHEMIC STROKE

SUN Ying, LI Haixian,WU Hairong,HOU Shugang,ZHOU Chang,ZHANG Chen (Department of Neurology,The Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College,Qingdao 266003,China)

ObjectiveTo elucidate the relationship between leukotriene C4 synthetase rs730012(-444A/C)gene polymorphism and cerebral ischemic stroke(CIS).MethodsWith polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism(PCR-RFLP)and agarose gel electrophoresis techniques,the leukotriene C4 synthetase rs730012 gene polymorphism in CIS group and in age-and sex-matched control group were detected and compared in terms of the differences of genotype and allele frequency between the two groups.The association of the gene polymorphism and the occurrence of CIS was analyzed by logistic regression to adjust confounding variables.ResultsLogistic regression analysis showed that population with AA genotype of rs730012 had a 1.6-fold higher risk of suffering from CIS than those with AC＋CC genotypes(OR＝1.636,P＜0.05).ConclusionThe polymorphisms of rs730012 in leukotriene C4 synthetase may be related to CIS.Allele A is probably the risk allele.

leukotriene C4;cerebrovascular accident;polymorphism,single nucleotide

R743

A

1008-0341(2013)04-0328-03

10.11712/qlyx201304015

2013-03-07;

2013-06-01

山東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(ZR2010HM061)

孫瑛(1987-),女,在讀碩士研究生。

張晨(1957-),男,教授,博士生導(dǎo)師。