Livin在妊娠滋養細胞腫瘤中的表達及意義

劉 韡 馬 瑞 王艷霞 安瑞芳

1.西安交通大學第二附屬醫院婦產科，陜西西安 710004；2.陜西省婦幼保健院，陜西西安 710004；3.西安交通大學第一附屬醫院婦產科，陜西西安 710061

妊娠滋養細胞疾病（GTD）主要包括完全性葡萄胎（complete hydatidiform mole，CHM）、部 分 性 葡 萄 胎（partial hydatidiform mole，PHM）、侵蝕性葡萄胎（invasive hydatidiform mole，IHM）和絨毛膜癌（choriocarcinoma，CC）等，另外還包括胎盤部位滋養細胞腫瘤（placental site trophoblastic tumor，PSTT）和上皮樣滋養細胞腫瘤（epihtelialrtophoblastieutmor，ETT）等少見類型。除葡萄胎外，又統稱為妊娠滋養細胞腫瘤（gestational trophoblastic neoplasia，GTN），侵蝕性葡萄胎全部來自葡萄胎，而其他滋養細胞腫瘤可以來自正常或異常妊娠[1]。

妊娠滋養細胞腫瘤是一類嚴重威脅女性生殖健康的疾病，目前，主要靠動態觀察血β-HCG 的變化及臨床癥狀、體征來診斷GTN 及預測起惡變及預后，但這些臨床特點的出現，具滯后性，甚至延誤治療[2]。因此，尋找新的治療藥物和有效的預后標記物，以及攻克本疾病仍需要不斷進一步的研究。隨著分子生物學技術的發展，研究發現多種因素參與其發病過程，比如癌基因、抑癌基因，凋亡因子，抑制凋亡因子等。

凋亡抑制蛋白（Inhibitor of apoptosis proteins，IAP）是一類內源性細胞抑制因子，在很多物種中起抑制凋亡的作用，其過度表達引起凋亡不足、增殖過度，與腫瘤的發生密切相關。尋找有效的IAP 抑制劑，在腫瘤的治療中有著廣泛的應用前景[3-4]。Livin（又稱KIAP，ML-IAP）是最新發現的一個IAP 家族中的成員，因其在腫瘤組織中的特異性高表達，已經成為近期研究的熱點[5-6]。目前研究表明多種凋亡相關基因參與妊娠滋養細胞疾病的發生、發展，但Livin 蛋白在妊娠滋養細胞疾病中的表達以及相關性的研究卻鮮有所見。

1 資料與方法

1.1 一般資料

22 例妊娠滋養細胞腫瘤患者病例均來自1993 年1月～2006 年1 月西安交通大學醫學院第一附屬醫院。患者均為女性，年齡最小21 歲，最大53 歲，平均32.6 歲。手術治療的侵蝕性葡萄胎患者的標本14 例，手術治療的絨癌患者的標本8 例。并隨機選擇正常妊娠（5 ～12 周）行人工流產終止妊娠者的絨毛組織(正常絨毛細胞組)10 例作為對照。全部病例均經組織病理學證實。

1.2 主要試劑

兔抗人Livin 多克隆抗體購自北京博奧森生物技術有限公司。兔SABC 檢測試劑盒（SP-9001）購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.3 實驗方法

取上述病例蠟塊切片，厚4μm，采用免疫組織化學鏈霉親和素生物素過氧化物酶復合物（SABC）法檢測。陰性對照：以磷酸鹽緩沖液（PBS）代替第1 抗體；陽性對照：用已知陽性染色切片作陽性對照。

1.4 結果判定

每張切片選擇有代表性的區域，并避開切片周邊區域，觀察陽性反應采用雙盲法，并由有經驗的病理科醫師觀察每張切片后一起做出判斷。以滋養細胞胞漿或胞核出現棕黃色顆粒為陽性，每張切片顯微鏡下隨機觀察10 個視野，高倍鏡（×400）下綜合染色強度和陽性細胞所占比例進行半定量測定。染色強度評分標準：染色強度以不著色為0 分，淺黃色為1 分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；陽性細胞數＜5%為0 分，5%～25%為1 分，26% ～50%為2 分，＞50%為3 分。

染色強度×陽性細胞百分數為每例組織染色的綜合記分。0 ～1 分為陰性（-），2 ～3 分為弱陽性（+），4 ～6 分為陽性（++），＞6 分為強陽性（+++）。

1.5 統計學方法

采用SPSS13.0 軟件包進行統計學分析，用四格表Fisher’s 確切概率法和Spearman 等級相關分析對數據進行處理，以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Livin在GTN組織中的表達

在正常絨毛組織、GTN 中，Livin 的表達主要定位于合體滋養細胞和細胞滋養細胞的細胞核中，部分定位于細胞漿中。 細胞核棕黃色或棕褐色為陽性細胞，呈均勻染色狀。正常絨毛組織、GTN 中Livin 的表達情況見圖2 ～4。

表1，圖1 結果可見，Livin 在正常絨毛組織和GTN組織中均有所表達，在侵蝕性葡萄胎、絨癌組織中表達明顯，陽性率分別為100%（20/20）、57.1%（8/14）和87.5%（7/8），正常組織與GTN 組織中Livin 的表達差異具有統計學意義（x2=20.391，P ＜0.05）;利用Fisher確切概率法在四組之間進行兩兩比較發現，Livin 在侵葡和絨癌組織中的表達顯著高于正常絨毛組織，差異均具統計學意義（P ＜0.05）。

表1 Livin在正常絨毛和GTN組織中的表達

圖1 Livin 在正常絨毛和GTD 組織中的表達情況

2.2 Livin在GTN中的表達與臨床特征的關系

由表2 結果可見，Livin 在22 例GTN 組織中的表達率為68.2%，Livin 在GTN 中的表達與臨床分期具有相關性（P ＜0.05），且Ⅱ期＞Ⅰ期＞Ⅲ期，Livin 與GTN 患者的年齡、前次妊娠是否為葡萄胎、治療前HCG 值的高低、是否有轉移及預后無明顯相關性（P ＞0.05）。

表2 Livin 在GTN中的表達與臨床特征的關系

近十年來，妊娠滋養細胞疾病的分子生物學研究取得很大的發展，眾多學者已經發現多種腫瘤標志物，與GTN 的發病發展有關，包括：白介素、腫瘤壞死因子、血管內皮生長因子、增殖性標志物中的PCNA、Ki-67、金屬蛋白酶及其抑制物以及癌基因、抑癌基因等[7]。

圖1 Livin 在正常絨毛中的陽性表達（×400）

圖2 Livin 在侵葡中的陽性表達（×400）

圖3 Livin 在絨癌中的陽性表達（×400）

3 討論

研究表明，細胞凋亡(即細胞程序性死亡)的程序失去控制在腫瘤形成過程中有十分重要的作用[8]。參與調節細胞凋亡的基因就有可能參與了腫瘤的發生、發展過程，主要與三個基因家族即Bcl-2 家族、caspase 家族和凋亡抑制蛋白（Inhibitoror of apoptosis，IAP）家族關系密切[9-10]。

IAP 是一類內源性細胞抑制因子，其過度表達抑制細胞凋亡與腫瘤發生關系密切。Livin 作為一種新發現的IAP 家族成員，其具有的特異性BIR 和RING 指結構域，可以通過多種途徑發揮抑制細胞調亡作用，主要是通過抑制Caspase 蛋白的級聯激活反應來抑制凋亡過程[11-12]。目前，國內外文獻中Livin 在GTD 中表達情況的鮮有報道。有相關研究表明，凋亡相關因子與葡萄胎的惡變相關，可能與滋養細胞低凋亡活性有關[13]。我們的研究結果顯示Livin 在GTD 組織中，表達于細胞滋養細胞和合體滋養細胞的細胞核中，少部分表達在細胞質中，這與其他文獻中的報道一致，但是我們無法解釋為什么Livin 主要表達在細胞核中，而不是細胞質中，有可能是因為Livin 有兩種不同形式的存在方式Livin α 和Livin β，這兩種分子有不同的生物學特性及組織分布類型，但是它們都在凋亡信號啟動后有著抑制凋亡的作用，兩者起著相互協調的作用[14-17]。而在我們的試驗中，單純用免疫組織化學法是無法區分出到底是兩者中的哪個起著主要作用，這有待于在將來的研究中找出兩者在細胞中的不同的定位。

本實驗表明，Livin 蛋白在GTN 中的表達與患者的年齡、前次妊娠是否為葡萄胎、治療前HCG 的水平、有無轉移、及預后無明顯相關性，但Livin 與GTN 組織臨床分期有明顯相關性，說明Livin 蛋白的表達可能與GTN 的臨床分期有關，但Livin 在GTN 中的表達Ⅱ期＞Ⅰ期＞Ⅲ期，卻不是明顯的正相關或負相關。因此本實驗提示Livin 參與了GTD 的發病，并且與腫瘤的臨床分期有關，但與其他研究中不同的是Livin 蛋白的表達與腫瘤的多項臨床特征的相關性不明顯，這有可能是因為不同腫瘤的發生機制不同，組織結構也不同，所以研究的結果也不盡相同，但也有可能與本實驗樣本量較少有關，這可以在以后的研究中進一步探討。但是Livin 蛋白在GTD 中的高表達，以及抗凋亡作用的增強，還是可以說明，Livin 蛋白有可能作為GTD 診斷、預后不良的一個參考指標之一。

綜上所述，Livin 在妊娠滋養細胞腫瘤中的高表達，提示可能參與了妊娠滋養細胞腫瘤的發生、發展，為臨床診斷及治療尋找新的作用靶點。

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