環介導等溫擴增法快速檢測乳中阪崎腸桿菌

董鑫悅，滿朝新，盧 雁，郭 穎，王今雨，楊相宜，郎 友，龐心怡，姜毓君，，*

(1.東北農業大學國家乳業工程技術研究中心，黑龍江哈爾濱150086; 2.東北農業大學食品學院，乳品科學教育部重點實驗室，黑龍江哈爾濱150030)

阪崎腸桿菌(Enterobacter sakazakii)是一種革蘭氏陰性、無芽孢的兼性厭氧細菌［1］。它能導致任何年齡層人群的疾病，尤其是對早產兒、出生體重輕的嬰兒或免疫受損嬰兒的威脅最大，能引起新生兒敗血癥、腦膜炎和壞死性小腸結腸炎［2］。然而，傳統的檢測方法操作復雜、耗時長以及需要復雜昂貴的儀器［3］。因此，建立一種快速簡便的檢測阪崎腸桿菌的方法一直是眾多學者研究的熱點。環介導等溫擴增技術(loop－mediated isothermal amplification，LAMP)由Notom i等于2000年建立，該技術針對靶基因的6個區域設計4種特異引物，利用具有鏈置換活性的Bst DNA聚合酶，在恒溫條件下(60～65℃)高效(0.5～1.0h)擴增目標DNA，具有很高的特異性和靈敏度，快速簡便，擴增產物量大，肉眼、電泳、濁度儀或肉眼均可進行檢測［4－5］。本研究擬利用環介導等溫擴增技術檢測乳中的阪崎腸桿菌，建立一種快速檢測乳中阪崎腸桿菌的方法，為這一方法的推廣應用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

阪崎腸桿菌(ATCC29544、ATCC51329)、金黃色葡萄球菌(ATCC13565、CMCC26074、CMCC26075、CMCC26112)、鼠傷寒沙門氏菌(CMCC50222)、亞利桑那沙門氏菌(CMCC47020)、都柏林沙門氏菌(CMCC50042)、湯卜遜沙門氏菌(CMCC50120)、單增李斯特菌(CMCC54004、CMCC54006、CMCC54002)

中國食品藥品檢定研究院;大腸桿菌(ATCC25922)、大腸桿菌 O1、英諾克李斯特菌(ATCC33090)、銅綠假單胞桿菌(ATCC27853)、蠟樣芽孢桿菌 (CMCC63303)、福氏志賀氏菌(CMCC51572) 福建省疾病預防控制中心;阪崎腸桿菌(BQ－1、BQ－2)、大腸桿菌O157:H7、藤黃微球菌(ATCC4698) 實驗室保存Bst大片段DNA聚合酶 New England Biolab;細菌基因組DNA提取試劑盒 北京百泰克生物技術有限公司;甜菜堿(Betaine) 美國Sigma公司;DNA提取液(0.1mol/L Tris－Hcl、0.1mol/L EDTA、0.1mol/L Na3PO4、1.5mol/L NaCl、1%CTAB，溶解后調節pH8.0，室溫保存);9700型PCR儀 美國ABI公司;UVP凝膠成像系統 美國UVP公司;引物序列由英濰捷基(上海)貿易有限公司合成。

1.2 實驗方法

1.2.1 細菌培養以及DNA模板的制備 阪崎腸桿菌ATCC29544及23株其他菌株培養于營養肉湯培養基中，37℃培養到對數生長期。按照細菌基因組DNA抽提試劑盒說明書提取細菌基因組DNA，溶于無菌水中，－20℃保存備用。

1.2.2 引物設計及合成 選取Genbank中阪崎腸桿菌 OmpA 基 因 序 列［6］(Accession number: DQ000206)，利用LAMP引物在線設計軟件設計一套特異性引物，包括B3，F3，FIP，BIP，LF，LB。引物序列:B3－GATTCGCCCATACCACGAT;

1.2.3 LAMP反應的體系優化與確立

1.2.3.1 LAMP反應體系的優化 參考文獻［7－9］，選擇不同濃度比例的外引物和內引物(1∶4～1∶9)、不同濃度比例的外引物和環引物(1∶1～1∶5)、不同濃度梯度的MgCl2(0～6mmol/L)、不同濃度梯度的dNTPs (0.4～2.4mmol/L)、不同添加量的Bst DNA聚合酶(0.5～1.0μL)進行LAMP反應，電泳觀察擴增結果，根據是否形成典型的梯狀條帶以及條帶的亮暗來確定最佳反應條件。

1.2.3.2 LAMP反應體系 配制25μL反應體系，分別將一定量的內引物、外引物、環引物、MgCl2、脫氧核糖核苷酸(dNTPs)、甜菜堿、Bst DNA聚合酶大片段、10×Buffer、DNA模板混勻，用滅菌水補齊。反應條件:95℃5m in，迅速冷卻加入酶，64℃保持40m in，80℃保持2min反應結束。

1.2.4 LAMP檢測阪崎腸桿菌的靈敏度和特異性 將計好數的阪崎腸桿菌液進行十倍梯度稀釋，取各稀釋度菌液1m L，提取其DNA，取2μL作為模板進行PCR和LAMP反應。

用建立的LAMP方法分別對上述所列4株阪崎腸桿菌和19株非阪崎腸桿菌進行擴增，電泳觀察結果，驗證LAMP方法特異性。

1.2.5 LAMP檢測人工污染乳中阪崎腸桿菌

1.2.5.1 人工污染乳中阪崎腸桿菌基因組DNA的提取方法比較 試劑盒法(細菌基因組DNA提取試劑盒)按照說明書的步驟進行DNA提取;熱裂解法:人工污染的滅菌乳中分別加入1m L無水乙醇、1m L氯仿、1m L氨水混勻。12000 r/m in離心10min棄上清。加入200μL滅菌水混勻后，10000 r/m in離心1m in，棄上清。加入100μL滅菌水混勻，于沸水浴中煮沸10m in，10000r/min離心1m in，取上清－20℃備用;蛋白酶K法:1m L樣品中分別加入1m L DNA提取液、10μL溶菌酶、10μL蛋白酶K混勻后，37℃ 200 r/m in振蕩孵育1.5h。加入50μL的20%SDS，65℃孵育20m in。然后，12000r/min離心1min，取上清。在得到的上清液中加入1m L的異丙醇，混勻后加入吸附柱AC中10000 r/min離心30s，去上清。所得的沉淀用預冷的70%乙醇重復洗滌和干燥三次。最后加入50μL的TE緩沖液溶解DNA，－20℃保存備用。

1.2.5.2 人工污染乳的檢出限 從當地超市購買的液體乳經過滅菌后，人為添加不同稀釋度的阪崎腸桿菌于乳中。分別提取各個稀釋度人工污染乳中阪崎腸桿菌的DNA，取2μL作為模板進行LAMP反應。

2 結果與討論

2.1 LAMP檢測方法的建立

對阪崎腸桿菌ATCC29544的DNA模板進行擴增，肉眼可見渾濁，瓊脂糖凝膠電泳后出現典型的梯形條帶。

圖1 阪崎腸桿菌標準菌株LAMP檢測結果Fig.1 LAMP detection of Enterobacter sakazakii

2.2 LAMP反應體系的優化

通過上述優化方法，最終確定LAMP的反應體系為:0.2μmol/L外引物，1.6μmol/L內引物，0.6μmol/L環引物，2mmol/L MgCl2，2mmol/L dNTPs，1μL的Bst DNA聚合酶(8U)，10×Buffer及2μL模板。在此反應體系下，得到最佳的擴增效果，保證了結果的穩定性和特異性。

2.3 LAMP檢測純培養物的靈敏度

經平板計數，原始菌液濃度為3.7×109cfu/m L。從圖2可見，泳道2～10都有LAMP擴增條帶，而11、 12未見LAMP擴增。由此可見，本研究建立的LAMP方法對阪崎腸桿菌純培養物的檢出限為 3.7×101cfu/m L。

圖2 LAMP檢測阪崎腸桿菌純培養物的靈敏度電泳圖Fig.2 The sensitivity of LAMP reaction for Enterobacter sakazakii

由圖3可見，泳道2～9都有PCR擴增條帶，而10、11未見PCR擴增條帶。由此可見，PCR檢測阪崎腸桿菌的靈敏度為3.7×102cfu/m L。本實驗建立的LAMP方法靈敏度是PCR方法的10倍。

圖3 PCR檢測阪崎腸桿菌純培養物的靈敏度電泳圖Fig.3 The sensitivity of PCR reaction for Enterobacter sakazakii

2.4 LAMP特異性實驗

結果表明，兩株阪崎腸桿菌標準株以及兩株阪崎腸桿菌野株均呈陽性反應。其他19株非阪崎腸桿菌均呈陰性反應，未出現梯形條帶。

2.5 人工污染乳中阪崎腸桿菌DNA的提取

分別采用試劑盒法、熱裂解法以及手提DNA法提取人工污染乳中的阪崎腸桿菌DNA，LAMP擴增結果都有典型的梯形條帶，且差異不大。熱裂解法操作簡單，而且能節省很多時間，所以選取了熱裂解法提取乳中DNA。

2.6 人工污染乳中LAMP的檢測限

人工污染乳的阪崎腸桿菌的濃度從4.3×108～4.3×10－1cfu/m L，分別提取DNA進行LAMP反應，結果如圖6所示。泳道2～9均有LAMP擴增條帶，而10、11泳道未見擴增條帶。由此可見，LAMP檢測人工污染乳中阪崎腸桿菌的檢測限為4.3×101cfu/m L。

圖4 LAMP特異性實驗電泳圖Fig.4 The specificity of LAMP reaction

圖5 三種不同方法提取乳中DNA的LAMP實驗結果Fig.5 Three differentmethods of DNA extraction

圖6 LAMP檢測人工污染乳中阪崎腸桿的靈敏度電泳圖Fig.6 The sensitivity of LAMP reaction for Enterobacter sakazakii inmilk

3 結論

3.1 目前，阪崎腸桿菌的分子生物學檢測方法主要是PCR方法和熒光定量PCR法［10］。而LAMP方法應用到液體乳中的研究相對較少，本研究進行了LAMP檢測液體乳中阪崎腸桿菌的初步探索。本實驗建立的檢測乳中阪崎腸桿菌的LAMP方法，操作簡便，不需要復雜的儀器，反應過程只需水浴鍋即可［11］;LAMP引物的設計是針對6個區域設計的，特異性強［12］，根據特異性實驗同樣證明的這一點;靈敏度高［13］，本實驗建立的方法靈敏度比普通的PCR方法靈敏度高10倍左右;由于添加了環引物，使得LAMP反應時間大大減少。并且對于樣品處理方法進行了選擇優化，縮短了模板制備的時間，使得整個實驗過程能在2h內完成。

3.2 在LAMP方法中，設計出靈敏度高、特異性強的LAMP引物是實驗成功的關鍵點之一。在設計引物的時候，注意Tm值的設置、GC含量、引物末端穩定性、二級結構等問題［14］。本研究所建立的LAMP檢測乳中阪崎腸桿菌方法有很多地方需要進一步探索和完善［15］，例如結果鑒定的手段較為單一，主要依靠瓊脂糖凝膠電泳，不能滿足現場檢測的需求。而現有結果鑒定方法中，熒光染料法方便快捷，靈敏度較高。濁度檢測法則通過是否產生白色沉淀來判定是否進行LAMP反應［16］。所以，在以后的研究中可以對結果判定方面進行不同的探索。

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