基于正交設計與人工神經網絡模型的醋酸菌A3菌株醋酸發酵條件優化

宋勇強，贠建民，安志剛，韓慶輝

(甘肅農業大學食品科學與工程學院，甘肅蘭州730070)

涼州熏醋是甘肅名優產品，是在借鑒山西陳醋釀造技術的基礎上，結合當地環境條件通過工藝改造而形成的獨特工藝［1］。其釀造歷程是物料在各種無機、有機和生物復合體相互作用下的復雜反應過程，其中微生物作為發酵的源動力，是促使物質轉化的關鍵，而與食醋產量品質關系最密切的核心微生物就是典型優勢醋酸菌［2］。醋酸菌發酵條件作為一個多變量系統，該過程涉及活細胞體，周圍環境的微小變化都會引起微生物的不同生理反應，從而使代謝過程更趨于復雜，使整個產酸系統呈現高度的非線性和時變性，因此很難通過準確的數學模型找出使指標達到最佳值的因素水平組合［3］。在模型建立中，人們對人工神經網絡(Artificial Neural Network，ANN)的興趣日益增加。而應用最廣泛的網絡是采用誤差反向傳播算法前饋神經網絡(BP網絡)［4］。人工神經網絡模型與傳統的回歸模型相比表現出了較高的預測精度［5］。James S等［6］對人工神經網絡和響應曲面法進行了比較，結果表明人工神經網絡比響應曲面法好。一些研究人員已經將人工神經網絡成功應用于食品與發酵領域，如建模與控制［7-8］、加工與預測［9-10］和條件優化［11-12］等。為此，本實驗以甘肅涼州熏醋傳統釀造醋醅中分離出的一株高產酸醋酸菌A3作為出發菌株，采用正交設計與ANN模型相結合的方法優化其醋酸發酵條件，旨在為指導食醋生產提供一定的依據和參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

A3菌株 為Acetobacter pomorum，由甘肅農業大學微生物實驗室從甘肅涼州熏醋傳統釀造醋醅中分離得到;無水葡萄糖 分析純，天津市致遠化學試劑有限公司;碳酸鈣、瓊脂粉 均為分析純，天津市大茂化學試劑廠;乙醇、氫氧化鈉 均為分析純，天津市光復科技發展有限公司;酵母膏、酚酞指示劑 北京奧博星生物技術有限責任公司。

斜面培養基 無水葡萄糖1.5%，酵母膏1%，碳酸鈣2%、瓊脂2%，pH自然，滅菌后溫度降至70℃左右加入無水乙醇4%(V/V);種子培養液:挑取一環經30℃培養12h活化的斜面菌種，接種于20m L/ 250m L三角瓶發酵培養基中，30℃、150 r/m in振蕩培養30h;發酵培養基:無水葡萄糖1.5%，酵母膏1%，pH自然，滅菌后溫度降至70℃左右加入無水乙醇3%(V/V)。

YX-280A型手提式不銹鋼蒸汽滅菌器 上海三申醫療器械有限公司;HG303-4A電熱恒溫培養箱北京市光明醫療儀器廠;THZ-82N臺式恒溫振蕩器 上海躍進醫療器械有限公司;pHS-3C型酸度計上海佑科儀器儀表有限公司;DH-600A型電熱恒溫培養箱 北京科委永興儀器有限公司;SW-CJ-1FD型單人單面凈化工作臺 蘇州安泰空氣技術有限公司;XSP-C型生物顯微鏡 北京瑞宏誠科技發展有限公司;HHS型電熱恒溫水浴鍋 上海博訊實業有限公司醫療設備廠;FA1204B型電子天平 上海佑科儀器儀表有限公司。

1.2 產酸量測定

量取20m L蒸餾水加入250m L三角瓶中，加酚酞指示劑2滴，將1m L發酵液加入三角瓶中，搖勻后用堿式滴定法測定產酸量(以醋酸計)，按公式1計算:

式中:C-0.1mol/L NaOH標準溶液;V-發酵后樣品滴定NaOH消耗量，m L;V0-發酵前樣品滴定NaOH消耗量，m L;60.06-醋酸的摩爾質量，g/mol。

1.3 發酵條件優化設計

1.3.1 單因素實驗設計

1.3.1.1 發酵溫度對產酸量的影響 將活化的醋酸菌A3接入已滅菌的發酵培養基中，在以下條件進行揺瓶發酵:接種量10%，乙醇濃度4%，pH5.0，搖床轉速150 r/m in，發酵時間6d，發酵溫度分別設為24、26、28、30、32、34、36℃。發酵結束后測定發酵液中的產酸量。

1.3.1.2 乙醇濃度對產酸量的影響 在篩選的最佳溫度及在其他發酵條件同1.3.1.1的前提下，將乙醇濃度分別設為2%、4%、6%、8%、10%、12%，進行發酵實驗，發酵結束后測定發酵液中的產酸量。

1.3.1.3 初始pH對產酸量的影響 在篩選的最佳溫度和乙醇濃度下，控制接種量 10%，搖床轉速150 r/m in，發酵時間6d，并將初始pH分別設為3、4、5、6、7、8、9。發酵結束后測定發酵液中的產酸量。

1.3.1.4 發酵時間對產酸量的影響 在上述篩選的最佳條件下，分別測定1～8d內不同發酵時間段的產酸量，以確定最佳發酵周期。

1.3.1.5 搖床轉速對產酸量的影響 在上述篩選的最佳條件下，控制接種量10%，發酵時間8d，搖床轉速分別設為100、125、150、175、200 r/m in。發酵結束后測定發酵液中的產酸量。

1.3.2 正交設計 采用L16(45)正交設計，以發酵液產酸量為指標，將菌種活化12h，在接種量10%，轉速150 r/m in的條件下進行醋酸發酵實驗，考察初始乙醇濃度、發酵溫度、起始pH及發酵時間對醋酸菌產酸量的影響，實驗因素及水平見表1。

表1 正交實驗因素與水平Table1 Factors and levels of orthogonal test

1.3.3 神經網絡模型的建立 在正交實驗結果的基礎上建立BP人工神經網絡模型，利用正交實驗數據作為對BP網絡的訓練樣本。在學習和訓練過程中，通過調節連接權值和閾值使網絡達到預期的誤差范圍內，并用另外兩組數據17號和18號來檢驗模型的泛化能力。運用建立好的網絡模型進行數據仿真，得出醋酸菌最佳發酵條件。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 發酵溫度對產酸量的影響 由圖1可知，隨著發酵溫度的升高，發酵液的醋酸含量先增加后降低。30℃時產酸最高，當發酵溫度超過32℃后產酸量開始下降。這是由于發酵過程中，發酵溫度過高使菌體老化加快，而溫度過低時，不利于醋酸菌的生長，產酸量也低。所以在做正交實驗時宜選用28、30、32、34℃。

圖1 發酵溫度對產酸量的影響Fig.1 Effect of fermentation temperature on the content of acetic acid

2.1.2 乙醇濃度對產酸量的影響 由圖2可知，當發酵液中的乙醇濃度為4%左右時醋酸含量最高，但是隨著乙醇濃度的增大，產酸量卻呈現下降趨勢，當乙醇濃度達到12%時產酸量僅為0.6189g/100m L，其原因可能是當發酵液中的乙醇含量較低時，醋酸菌的作用底物不足，產酸量也就相應的較低;當發酵液中的乙醇含量過高時，雖然理論上可以為醋酸菌提供較多的作用底物，但是高濃度的乙醇會對醋酸菌的發酵活力產生抑制作用［13］。因此選用乙醇濃度為2%、4%、6%、8%。

圖2 乙醇濃度對產酸量的影響Fig.2 Effect of concentration of alcohol on the content of acetic acid

2.1.3 pH對產酸量的影響 由圖3可知，隨著發酵液初始pH的升高，發酵液的醋酸含量呈現出先增長后下降的趨勢。在pH6.0附近產酸量達到最大值，之后隨著發酵液pH的增大產酸量開始大幅度降低。這是由于醋酸菌的最適生長pH為5.5～6.5，過高或過低都不利于醋酸菌生長;另外一般微生物體內的酶，其最適pH多在5.5～8.0之間［14］，因此做正交實驗時選用pH為4、5、6、7。

圖3 pH對產酸量的影響Fig.3 Effect of pH value on the content of acetic acid

2.1.4 發酵時間對產酸量的影響 由圖4可知，隨著發酵時間的延長，醋酸菌產酸量呈現遞增趨勢，前5d產酸量增大趨勢明顯，從第5d開始，發酵液中的醋酸含量增勢趨緩，并在第8d時達到最大。因此宜選用發酵時間為5、6、7、8d。

2.1.5 搖床轉速對產酸量的影響 醋酸菌是一種專性好氧菌，根據醋酸菌的生命代謝活動規律，除了需要豐富的營養物質外還必須有足夠的氧氣供應［15］，而發酵液中的溶解氧與搖床轉速有關。由圖5可知，在供試搖床轉速范圍內，發酵液中的醋酸含量隨著搖床轉速的增大而升高，當搖床轉速達到150 r/m in時，產酸量達到最大，但之后隨著搖床轉速的繼續增大產酸量趨于穩定。其原因是當搖床轉速達到150 r/m in時，發酵液中的溶液氧已經能夠滿足醋酸菌的生長需求，即達到了溶解氧的供需平衡。因此在之后的正交實驗時將搖床轉速確定為150 r/m in。

圖4 發酵時間對產酸量的影響Fig.4 Effect of fermentation time on the content of acetic acid

圖5 搖床轉速對產酸量的影響Fig.5 Effect of shaking speed on the concent of acetic acid

2.2 正交實驗數據分析

根據單因素實驗結果，確定出4種主要影響醋酸菌產酸的因素［16］，按照正交表設計進行實驗，表2中17號和18號實驗作為檢驗網絡泛化能力的數據不屬于正交設計范圍內，結果見表2。

表2 正交實驗結果Table2 Results of orthogonal test

表4 最優組合下A3菌株的產酸量Table4 The yield of acetic acid under optimal combination of bacterial strain A3

由表3極差分析結果可知:在實驗取值范圍內，影響因素中對產酸量影響最大的是乙醇濃度(R= 1.987)，其次是發酵時間(R=1.526)，再次是pH(R=0.721)，而對產酸量影響最小的是發酵溫度(R=0.581)。從極差分析表中可以得出每個因素的最佳水平，將其組合在一起即為最優組合:乙醇濃度4%、發酵溫度30℃、起始pH6.0和發酵時間8d。

表3 極差分析Table3 Analysis of range

綜上所述，由于在表2正交實驗中得出的最高產酸量的發酵條件為:乙醇濃度4%、溫度30℃、起始pH4.0、發酵時間8d，產酸量達到3.6129g/100m L;而在極差分析結果中得出的最優組合為乙醇濃度4%、發酵溫度30℃、起始pH6.0、發酵時間8d，二者不一致，故有必要通過驗證實驗進行比較，即在乙醇濃度4%、發酵溫度30℃、起始pH6.0、發酵時間8d的條件下開展醋酸發酵實驗，測定該醋酸菌A3菌株的產酸量，重復測定6次，實驗結果如表4。

由實驗結果表4得出在最優組合即乙醇濃度4%、發酵溫度30℃、起始pH6.0、發酵時間8d的條件下，醋酸菌 A3菌株的產酸量平均值為 3.9089g/ 100m L。顯然在該最優組合下A3菌株的產酸量要明顯高于在正交表2中得出的最高產酸量。故得出最佳發酵條件為:乙醇濃度4%、溫度30℃、起始pH6.0、發酵時間8d。

通過表5方差分析可以得出供試溫度范圍對產酸量的影響不顯著，而初始乙醇濃度、起始pH和發酵時間對產酸量均有顯著影響。因而，除去溫度因素，以其他三個因素的水平分別作橫坐標，產酸量為縱坐標，做出因素與產酸量的關系圖，結果見圖6～圖7。

表5 方差分析Table5 Analysis of variance

從圖6可知，在乙醇濃度4%和起始pH6.0附近，A3菌株的發酵產酸量最大;由圖7可知，隨著發酵時間延長，產酸量呈增大趨勢，在本實驗供試條件下，8d產酸量最大。

綜上所述，根據正交設計實驗結果分析所得出的最優組合即初始乙醇濃度4%、起始pH6.0和發酵時間8d為最佳發酵條件，但不一定是全局最佳發酵條件，有可能在乙醇濃度4%和起始pH6.0附近存有更好的發酵條件，因此，本實驗在首先確定發酵溫度和發酵時間兩因素的最佳水平為30℃和8d的基礎上，擬通過引入人工神經網絡模型的仿真模擬去尋找更精確的發酵條件。

圖6 乙醇濃度和pH對產酸量的影響Fig.6 Effect of concentration of alcohol and pH value on the content of acid

圖7 發酵時間對產酸量的影響Fig.7 Effect of fermentation time on the content of acid

2.3 BP人工神經網絡模型的建立、仿真及優化分析

本實驗建立三層神經網絡，三層網絡的結構由輸入層、隱含層和輸出層組成。利用Matlab7.0神經網絡工具箱，隨機選取正交實驗中的14組因素水平組合作為輸入樣本，數據見表2，用產酸量結果作為相應輸入樣本所對應導出信號，輸入向量P與目標向量T見圖8(1)和圖8(2)。由于輸入層和輸出層的節點數已確定，所以隱含層節點數的選取將會影響網絡模型的性能，通過調整隱含層神經元個數和訓練次數，使網絡性能函數均方誤差MSE達到工作要求(goal=0.0001)，三層BP網絡模型建立成功，輸入層4個節點，隱含層5個節點，輸出層1個節點，節點傳遞函數為單極性的Sigmoid函數，見圖8。

將實驗值與仿真值進行了比較［17］，見圖9，結果顯示出網絡模型具有很好的仿真性能。用建立好的神經網絡模型對第17組和第18組數據進行仿真模擬，結果見表2，仿真模擬結果表明網絡有較好的泛化能力，相對誤差小于0.5%，達到實驗要求。

圖8 人工神經網絡結構Fig.8 Architecture of ANN

圖9 人工神經網絡模型仿真Fig.9 Simulation of ANN mold

根據2.2正交實驗數據的分析，確定發酵溫度和發酵時間為30℃和8d，將pH固定為6.0，運用建立好的網絡模型在初始乙醇濃度4%附近進行數據仿真，結果見圖10。從圖10中得出初始乙醇濃度4.2%為最佳濃度;在乙醇濃度4.2%、溫度30℃和發酵時間8d的條件下，應用網絡模型在pH6.0附近進行數據仿真，結果見圖11。從圖11中得出pH6.4為最佳起始pH。至此，得出最佳發酵條件為:乙醇濃度4.2%、發酵溫度30℃、初始pH6.4、發酵時間8d。通過模型仿真得出產酸量為4.3234g/100m L，最佳發酵條件下的實驗產酸量為4.3086g/100m L。

圖10 乙醇濃度3%～5%對產酸量影響的仿真結果Fig.1 0 The simulation result of effect of concentration of alcohol 3%～5%on the content of acetic acid

3 結論

3.1 從正交實驗結果得出的最優組合為初始乙醇濃度4.0%、發酵溫度30℃、pH6.0、發酵時間8d，此發酵條件下產酸量為3.9089g/100m L，但由于這種尋優方法只是通過少量實驗次數達到尋找最優組合，因而實驗結果具有一定的局部性。

圖11 pH5～7對產酸量影響的仿真結果Fig.1 1 The simulation result of effect of pH value 5～7 on the content of acetic acid

3.2 運用BP網絡模型在正交實驗分析基礎上仿真計算尋找得出最佳醋酸發酵條件為初始乙醇濃度4.2%(v/v)、發酵溫度30℃、起始pH6.4、發酵時間8d，BP網絡模型仿真產酸量達到最高 4.3234g/ 100m L，此條件下的實驗產酸量為4.3086g/100m L，相比正交實驗所得最佳發酵條件下的產酸量提高了10.23%，尋找到了因素水平內的全局最佳組合，為醋酸發酵尋找到了精確的控制條件。

因此，本實驗進一步證明了采用正交設計與ANN模型相偶聯的優化方法在食品與發酵領域條件優化研究方面具有其優越性。用正交設計實驗結果作為數據信息，結合人工神經網絡“黑箱”的特點，可使復雜的發酵多變量體系變成易于模擬和預測的模型，可方便地對發酵條件進行優化。

［1］安志剛，贠建民，張蕊，等.涼州熏醋傳統釀造過程中代謝產物動態變化分析［J］.食品科學，2011，32(9):198-203.

［2］包啟安.醋酸菌與其發酵的機理［J］.中國調味品，1989 (8):1-3.

［3］Ashok Pandey.Solid-state fermentation［J］.Biochemical Engineering Journal，2003，13:81-84.

［4］Kiran M Desai，Bhalchandra K Vaidya，Rekha SSinghal.Use of an artificialneural network inmodeling yeastbiomass and yield ofβ-glucan［J］.Process Biochemistry，2005，40:1617-1626.

［5］C R CHEN，H S RAMASWAMY，S O PRASHER.Dynamic modeling of retort processing using neural networks［J］.Journal of Food Processing and Preservation，2002，26(2):91-112.

［6］James S，Legge R，Buddman H.Comparitive study ofblack box and hybrid estimation methods in fed batch fermentation［J］.J Process Control，2002，12:113-121.

［7］Kurtanjek Z.Principal component ANN:for modeling and control of baker’s yeast production［J］.J Bitechnol，1998，65: 23-35.

［8］Ferriera LS，De Souza Jr MB，Folly ROM.Development of an alcohol fermentation control system based on biosensor measurement interpreted by neural networks［J］.Sens Actuators，2001，75:166-171.

［9］Y-H Zhu，TRajalahti，SLinko.Application ofneuralnetworksto lysine production［J］.The Chemical Engineering Journal，1996，62:207-214.

［10］G SMITTAL，J ZHANG.Use of artificial neural network to predict temperatures，moisture and fat in slab-shaped food with edible coating during deep-fat frying［J］.Journal of Food Science，2000，65(6):978-983.

［11］Tholudur A，Ramirez Fred W.Optimization of fed-batch bioreactor using neural network parameter function models［J］.Biotechnol Progress，1996，12:302-309.

［12］Jayati Ray Dutta，Pranab Kumar Dutta，Rintu Banerjee.Optimization of culture parameters for extracellular protease production from a newly isolated Pseudomonas sp.using response surface and artificial neural network models［J］.Process Biochemistry，2004，39:2193-2198.

［13］王春霞，杜連祥，路福平，等.紅棗果醋發酵條件的研究［J］.食品與發酵工業，2009，35(5):114-121.

［14］R.E.布坎南，N.E.吉布斯.伯杰細菌鑒定手冊［S］.中國科學院微生物研究所《伯杰細菌鑒定手冊》翻譯、組譯.第8版.北京:科學出版社，1984:362-366.

［15］何志剛，李偉新，林曉姿，等.枇杷酒醋化過程醋酸菌的生長、產酸及好氧的關系［J］.食品與發酵工業，2008，34(12): 22-25.

［16］董書閣，管斌，熊三玉，等.利用響應面分析法優化醋酸菌AD1的發酵條件［J］.食品與發酵工業，2007，33(3): 78-81.

［17］Martina C，Augusta C，Gerardo P.Use of an artificial neural network in modeling yeast biomass and yield ofβ-glucan［J］.Process Biochemistry，2005，40:1617-1626.