一株產脂肪酶芽孢桿菌的鑒定及其脂肪酶基因LIP的克隆分析

劉生峰，肖進文，周蓓莉，楊 俊，聶福平，王 昱，周 慶，李應國

(1.重慶出入境檢驗檢疫局，重慶400020; 2.重慶市進出口食品安全工程研究中心，重慶400020; 3.西南大學，重慶400715)

脂肪酶(Lipase，EC3.1.1.3，甘油酯水解酶)是指催化酯酰甘油水解的一類酶的總稱，是一類特殊的酯鍵水解酶，其天然底物是長鏈脂肪酸酯，既可以在兩相系統(油、水界面)中起作用，也可以在水相中起作用。脂肪酶作為生物催化劑可催化由不同底物出發的水解和合成反應，且反應不需要輔酶，反應條件溫和，副產物少。因此，脂肪酶的應用十分廣泛，如食品工業、醫藥衛生、化學化工、環境保護、能源開發等領域。微生物來源的脂肪酶具備廣泛的pH、溫度范圍以及底物專一性，是工業用脂肪酶研究的熱點。地衣芽孢桿菌(B.licheniform is)是一種革蘭氏陽性腐生性微生物，在自然界分布非常廣泛，生理特性豐富多樣，它可產生多種活性物質，包括脂肽類、肽類、磷脂類、多烯類、氨基酸類和核酸類物質。地衣芽孢桿菌具有耐熱、酶系豐富、產酶量更高和安全等諸多優良特性，被認為是較理想的工業生產菌株［1］，與枯草芽孢桿菌相比，地衣芽孢桿菌生長溫度高5～7℃，地衣芽孢桿菌所分泌的酶系成為工業酶制劑的重要來源，其模式菌株的基因組序列也于2004年公布［2-3］。近年來，國內外對于地衣芽孢桿菌應用的報道日益增多，尤其在醫藥、飼料加工、農藥等行業地衣芽孢桿菌已得到廣泛的應用。地衣芽孢桿菌的功能基因，如纖維素酶［4］、β-甘露聚糖酶［5］、葡聚糖酶［6-7］、蛋白酶［8-10］、α淀粉酶［11-13］、亮氨酸脫氫酶［14］、堿性果膠酶［15］、植酸酶［16］、γ-聚谷氨酸降解酶［17］等都得到了克隆表達。本研究對實驗室分離的一株芽孢桿菌進行初步鑒定并對其脂肪酶基因LIP進行克隆和序列分析，為進一步構建工程菌奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

芽孢桿菌菌株BL03 由本實驗室分離保藏;大腸桿菌(Escherichia coli)JM109 由本實驗室保藏;質粒載體pMD19-T、PCR擴增試劑、膠回收試劑盒和載體連接試劑盒 寶生物工程(大連)有限公司;營養瓊脂培養基、芽孢染色試劑和革蘭氏染色試劑 北京陸橋技術有限責任公司;LB培養基 英國OXOID公司;芽孢桿菌生化鑒定卡 生物梅里埃公司;DNA提取試劑盒和質粒提取試劑盒 天根生化科技(北京)有限公司;引物 生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

BX51型熒光正置相差顯微鏡日本OLYMPUS公司;全自動微生物鑒定/藥敏分析系統-VITEK 32生物梅里埃公司;Mycycler核酸擴增儀和電泳儀美國Bio-Rad公司;200E型凝膠成像系統 美國SIM公司;IPP500型低溫培養箱 德國MEMMERT公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株鑒定 將菌株在營養瓊脂平板上劃線，37℃培養，觀察菌落形態，革蘭氏染色后鏡檢，觀察其菌體形態。生理生化鑒定參照《伯杰細菌鑒定手冊》［18］，用全自動微生物鑒定/藥敏分析系統-VITEK 32對菌株進行鑒定［19］。

1.2.2 LIP基因的PCR擴增 用細菌核酸提取試劑盒提取菌株BL03的基因組，用做PCR擴增的模板。根據GenBank中報道的B.licheniform is(ATCC 14580)菌株脂肪酶基因序列，應用Primer Prem ier 6.0軟件設計一對引物，為了便于亞克隆，在上下游引物的兩端分別設計一個EcoRI和NotI酶切位點，并在5＇端加入保護性堿基。上游引物:5＇-GGAATTC GTGCGTCGTCATTCATTT-3＇;下游引物:5＇-TAGCGGCCGCAATCTTATTTCCC-3＇。

LIP基因的體外擴增PCR反應總體積25μL:10 ×Buffer 2.5μL，10mmol/L dNTP 0.5μL，上、下游引物各0.5μL，地衣芽孢桿菌 DNA 1μL，DNA Taq酶0.5μL，25mmol/L MgCl22μL，ddH2O 17.5μL;反應條件:94℃預變性處理4m in;94℃變性30s，60℃退火30s;72℃延伸30s，30個循環;72℃延伸3min。1.5%瓊脂糖膠電泳鑒定結果。

1.2.3 LIP基因的克隆 用DNA回收試劑盒切膠回收純化PCR產物，目的片段與pMD19-T載體4℃連接過夜。連接產物轉化入E.coli JM109感受態細胞，并涂布于鋪有IPTG和X-gal的LB平板上，37℃倒置過夜。經藍白斑篩選，挑選白色菌落用LB液體增菌培養，小量抽提質粒，以質粒為模板，PCR擴增鑒定。

1.2.4 LIP基因測序及分析 LIP基因序列測定由上海Invitrogen公司進行。測序結果經DNASTAR 7.10軟件分析并與GenBank已發表的基因進行核酸序列比對。

2 結果與分析

2.1 菌株鑒定

2.1.1 菌體形態及菌落形態 在營養瓊脂平板上，培養初期菌落上積累較多黏液，牢固地附著在培養基上，培養后期呈裂葉狀，邊緣毛發狀(見圖1)，培養3d后菌落呈褶皺壘起的山丘狀。在液體培養基中靜止培養形成白色菌膜，能兼性厭氧生長。該菌革蘭氏染色為陽性(見圖2)，菌體為桿狀，菌株在生長過程中產生芽孢，可判定為芽孢桿菌。孢囊無膨大，無伴孢晶體，能運動。

圖1 菌株BL03在營養瓊脂上的菌落形態Fig.1 Colonymorphology of strain BL03 on nutrient agar plate

圖2 顯微鏡下菌株BL03菌體形態Fig.2 Morphlogy of strain BL03 undermicroscope

2.1.2 生理生化鑒定結果 用全自動微生物鑒定/藥敏分析系統-VITEK 32對菌株BL03進行鑒定，主要生理生化鑒定結果見表1，參照《伯杰細菌鑒定手冊》及儀器分析結果，初步鑒定為地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniform is)。

2.2 基因的PCR擴增

以Bacillus licheniformis染色體DNA為模板，按前述方法對其脂肪酶基因進行PCR擴增，成功擴增出一條大小約625bp的DNA片段(圖3)，結果與預期大小相符。

2.3 重組質粒的PCR鑒定

擴增培養白色菌落，小量抽提質粒后進行PCR擴增并電泳鑒定。結果顯示得到了大約625bp的DNA片段(圖4)，表明LIP/pMD19-T克隆體系構建成功。

2.4 序列測定及分析

測序結果表明LIP基因的開放閱讀框為615bp，編碼204個氨基酸。用DNAStar軟件預測氨基酸序列的分子質量、等電點，結果如下:LIP分子質量單位為21791.8u，理論等電點為9.32，堿性氨基酸殘基(Arg+Lys)百分比為8.3%，酸性氨基酸殘基(Asp+Glu)百分比為5.9%。包含有編碼脂肪酶的蛋白活性中心“G-x-S-x-x-G”的核酸序列，菌株BL03的脂肪酶基因核酸序列和推導氨基酸序列如圖5。

表1 BL03菌株主要生理生化特征Table1 Themajor physiological and biochemical characteristics of strain BL03

圖3 LIP基因的PCR擴增產物電泳圖Fig.3 Electrophoretogram analysis of LIP gene PCR product

圖4 重組質粒的PCR鑒定Fig.4 PCR identification of recombinant plasmids

菌株BL03的LIP基因與地衣芽孢桿菌ATCC 14580株LIP基因(GeneID:3098655)對比，核酸序列相似性達99.67%，推導理論氨基酸序列相似性為99.02%。與解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens FZB42G)的 LIP基因的核酸序列相似性僅為67.97%，推導理論氨基酸序列相似性為65.7%。與萎縮芽孢桿菌(B.atrophaeus)、解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)和短小芽孢桿菌(B.pum ilus)的基因序列進化樹分析如圖6。

3 結論

圖5 菌株BL03的脂肪酶基因核酸序列和推導氨基酸序列Fig.5 LIP gene sequence and putative amino acid sequence of BL03 strain

圖6 幾株芽孢桿菌的脂肪酶基因序列進化樹分析圖Fig.6 phylogenetic tree of lipase gene sequence analysis from some Bacillus

從自然界篩選出的天然菌株產酶能力一般不高，而通過基因重組技術將天然菌株中的目標基因克隆并構建工程菌株，實現較高的產酶能力，是獲得工業微生物菌種的重要途徑。天然菌株的分離鑒定及目標基因的克隆是構建基因工程菌株的基礎，自2004年公布地衣芽孢桿菌模式菌株(ATCC 14580)的基因組序列以來，對于地衣芽孢桿菌基因的研究有較多的報道，然而對于地衣芽孢桿菌基因的認識還比較有限，其基因的克隆也有限。因此從地衣芽孢桿菌中克隆出功能基因，開發出穩定性好、活力強、產量高的工程菌株，為工業化生產奠定堅實基礎，具有十分重要的實用價值。本研究對實驗室分離的一株芽孢桿菌從形態和生理生化特征初步鑒定為，地衣芽孢桿菌，根據在GenBank已經發表的地衣芽孢桿菌LIP基因序列設計引物，PCR體外擴增該片段，測序表明，獲取了LIP基因完整的開放閱讀框，該段序列與已發布的地衣芽孢桿菌脂肪酶基因(GeneID:3098655)相比，核酸序列相似為99.67%，僅有2個堿基的差異。為了便于定向亞克隆，在該基因上下游引物上分別設計了EcoRI和NotI酶切位點，LIP基因的獲取為后續研究該基因功能、工程菌株構建奠定了基礎。

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