熱帶莫氏蘭根提取物的抗氧化活性及穩定性研究

王呈文，紀明慧，陳光英，*，舒火明，2，*，孫崇格，林雪容

(1.海南師范大學“省部共建-熱帶藥用植物化學”教育部重點實驗，海南?？?71158; 2.海南經貿職業技術學院，海南?？?71127;3.三亞柏盈熱帶蘭花產業有限公司，海南三亞572000)

莫氏蘭(Mokara)為蘭科莫氏蘭屬植物［1-2］，是一種新型熱帶蘭花品種，具有茂盛的氣生根。近年來，海南熱帶蘭花莫氏蘭發展很迅速，已成為海南農業發展的一個經濟增長點。但是，主要集中在莫氏蘭花的培育以及銷售這兩方面，缺乏對其根的化學成分及藥理活性的研發，制約了莫氏蘭產業的健康可持續的發展［3-4］。據文獻報導，蘭花中主要含有多糖、酚類、萜類、黃酮等化合物，這些化合物都有很強的清除羥基自由基的活性［5］，這引起了人們研究莫氏蘭的廣泛興趣。本文采用超聲提取法提取莫氏蘭根中有效的抗氧化成分，考察其對羥基自由基(·OH)和DPPH自由基(DPPH·)的清除能力，為進一步開發利用莫氏蘭提供有效的科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

莫氏蘭根 均采于三亞柏盈熱帶蘭花產業有限公司，自然晾干，粉碎到100～200目備用;蘆丁標準品 中國藥品生物制品檢定所;DPPH· 美國Sigma-Aldrich公司;無水乙醇、過氧化氫、七水合硫酸亞鐵、鄰二氮菲、三羥甲基氨基甲烷、抗壞血酸(VC)、鹽酸、氫氧化鈉等 均為分析純。

TP-214型電子天平 丹佛儀器北京有限公司; TU-1901型雙光束紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司;RE-52A型旋轉蒸發器 上海亞榮生化儀器廠;SHB-Ⅲ型循環水式多用真空泵 鄭州長城科工貿有限公司;XO-5200DTS型超聲波清洗儀 南京先歐儀器制造有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 正交實驗 參考文獻［6-7］方法，通過預實驗，得出乙醇濃度(A)、料液比(B)、提取時間(C)、提取溫度(D)、提取功率(E)為影響莫氏蘭根提取物抗氧化活性的主要因素，因此設正交表L25(56)安排實驗，采用超聲波提取法對莫蘭根抗氧化活性物質進行提取，以DPPH·的清除率為評價指標，考察最佳提取工藝。水平因素表見表1。

表1 水平因素表Table1 Level and factors of orthogonal test

1.2.2 提取物的抗氧化活性研究

1.2.2.1 抗氧化物質的提取 稱取莫氏蘭根粉末100.0g，按1.2.1最佳提取工藝條件提取抗氧化物質，在60℃減壓濃縮至棕色浸膏10.0g，冷凍干燥，取1.0g提取物加無水乙醇溶解，定容至10m L容量瓶中配制成100mg/m L溶液。

1.2.2.2 提取物對·OH的清除作用 分別配制濃度為2、20、40、60、100、200、300μg/m L的莫氏蘭根乙醇提取物溶液，考察其對·OH清除作用。參照文獻［8-10］的方法進行測定。

1.2.2.3 提取物對DPPH·的清除作用 DPPH·是一種穩定的有機自由基，其溶液具有特征的紫紅色吸收峰，當存在自由基清除劑時，由于與其單電子配對而使其吸收逐漸消失，其褪色程度與其所接受的單電子數成定量關系，因而可用分光光度法進行定量分析。

反應體系中清除DPPH·的相對百分率，以VC為標準抗氧化劑與樣品進行比較，作出清除率隨濃度變化的曲線(以濃度為橫坐標，清除DPPH·的百分率為縱坐標)，計算出對自由基清除率達50%的清除劑用量來評價其清除DPPH·的能力(即半抑制濃度，IC50)。

分別配制濃度為10、20、40、60、80、100、200、300、400μg/m L的莫氏蘭根乙醇提取物溶液，考察其對DPPH·清除作用。樣品對DPPH·的清除作用，參照文獻［8-10］的方法進行測定。

1.2.3 提取物的穩定性研究

1.2.3.1 抗氧化活性保存率的計算 分別測定樣品處理前還原力C0(μg/m L)和經各種處理后的還原力C1(μg/m L)，則其抗氧化活性保存率為［11］:

1.2.3.2 pH對莫氏蘭根乙醇提取物抗氧化活性的影響 分別取5份濃度為60μg/m L的莫氏蘭根乙醇提取物，用0.1mol/L的NaOH溶液和0.1mol/L的HCl溶液，調節其pH為2、4、6、8、10，并保存4h。測定其對DPPH·的清除能力［12-15］，并計算活性保存率。

1.2.3.3 溫度對莫氏蘭根乙醇提取物抗氧化活性的影響 取3份濃度為60μg/m L的莫氏蘭根乙醇提取物溶液置于容量瓶中，分別在冰水浴鍋，溫度為:-10 (加入適量食鹽)、0、20℃的條件下;以及取4份濃度為60μg/m L的莫氏蘭根乙醇提取物溶液置于容量瓶中，分別在恒溫水浴鍋，溫度為:30、40、60、80℃的條件下保持4h，測定其對DPPH·的清除能力［12-15］，并計算活性保存率。

1.2.3.4 光對莫氏蘭根乙醇提取物抗氧化活性的影響 取3份濃度為60μg/m L的莫氏蘭根乙醇提取物溶液置于容量瓶中，分別放置于自然光照下、白熾燈光照下、避光條件下，每隔一天測定其對DPPH·的清除能力，連續測7d［12-15］，并計算活性保存率。

2 結果與討論

2.1 莫氏蘭根乙醇提取物最佳提取工藝條件的篩選

以L25(56)安排實驗，采用超聲波提取法對莫蘭根抗氧化活性物質進行提取，以DPPH·的清除率為評價指標，考察最佳提取工藝，結果見表2。

表2 正交實驗結果Table2 Orthogonal experiment results

從表2中直觀分析可以看出，乙醇濃度是影響提取物清除DPPH·活性的主要因素，因素影響的次序為:A＞D＞C＞B＞E，最佳的提取工藝條件為: A5B4C1D2E1，即無水乙醇，料液比為25mg:25m L，溫度為50℃，提取時間為1h時，提取功率為48W時，提取物對DPPH·的清除效果最好，以此最佳提取工藝條件進行3次驗證實驗，其對DPPH·的平均清除率可達到92.00%。

2.2 提取物的抗氧化活性研究

2.2.1 莫氏蘭根乙醇提取物對·OH的清除能力 由圖1可知，莫氏蘭根乙醇提取物對·OH有一定的清除能力，隨著濃度的增加，清除率也增加，濃度與清除率有一定的量效關系，莫氏蘭根乙醇提取物清除·OH的IC50=45.20μg/m L，同時測定了VC對·OH的清除能力，其IC50=104.75μg/m L，莫氏蘭根乙醇提取物對·OH的清除能力大于VC對·OH的清除能力。

圖1 清除羥基自由基的能力Fig.1 Effects of scavenging hydroxyl radical

2.2.2 莫氏蘭根乙醇提取物對DPPH· 的清除能力 由圖2可知，莫氏蘭根乙醇提取物對DPPH·有一定的清除能力，隨著濃度的增加，清除率也增加，存在一定的量效關系，其IC50=34.62μg/m L。同時測定了VC對DPPH·的清除能力，其IC50=72.40μg/m L。因此，莫氏蘭根乙醇提取物對DPPH·的清除能力大于VC對DPPH·的清除能力。

2.3 抗氧化穩定性

2.3.1 pH對莫氏蘭根乙醇提取物抗氧化活性的影響

由表3可知，莫氏蘭根乙醇提取物的抗氧化活性成分在堿性條件下能穩定存在，活性保持率在98%以上，但在酸性環境中，抗氧化成分不穩定，對DPPH·清除的活性降低，在pH為2時，活性降低了38.27%。

2.3.2 溫度對莫氏蘭根乙醇提取物抗氧化活性的影響 由表4可知，當溫度在-10～40℃時，莫氏蘭根乙醇提取物的抗氧化活性成分較穩定，對DPPH·的清除率基本不變，活性保持率在99%以上。當溫度升到80℃時提取物對DPPH·的清除率有下降的趨勢，但變化不大，活性保持率為86.68%，因此，莫氏蘭根乙醇提取物有較高的熱穩定性。

圖2 對DPPH·的清除能力Fig.2 Effects of scavenging DPPH free radical

表3 pH對莫氏蘭根乙醇提取物清除DPPH·的活性影響Table3 Effect of pH value on DPPH radical scavenging of the ERM

表4 溫度對莫氏蘭根乙醇提取物清除DPPH·的活性影響Table4 Effect of temperature on DPPH radical scavenging of ERM

表5 光對莫氏蘭根乙醇提取物清除DPPH·的活性影響Table5 Effect of light on DPPH radical scavenging of ERM

2.3.3 光對莫氏蘭根乙醇提取物抗氧化活性的影響 不同光照環境下，莫氏蘭根乙醇提取物對DPPH·的清除作用結果見表5，從表中可以看出，白熾燈照對莫氏蘭根乙醇提取物抗氧化活性影響較大，白熾燈照到7d時，活性保持率為57.67%。在自然光照和避光條件下，莫氏蘭根對DPPH·的清除率隨時間的延長呈下降趨勢，但在前4d時間里，活性保持率都在80%以上，故莫氏蘭根乙醇提取物對自然光有一定的穩定性。

3 結論

莫氏蘭根乙醇提取物的最佳的抗氧化活性提取工藝條件為:無水乙醇，料液比為25mg:25m L，溫度為50℃，提取時間為1h，功率為48W時，提取物抗氧化活性最好，對DPPH·的清除率可達到92.00%。提取物清除·OH的IC50為45.20μg/m L，清除DPPH·的IC50為34.62μg/m L，有較高的耐熱性和一定光穩定性，且在堿性條件下提取物抗氧化活性較穩定。

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