響應面優化超聲波法提取黑豆異黃酮的工藝研究

豆亞靜，張曉龍，常麗新，閆金萍，吳 丹

(1.河北聯合大學輕工學院，河北唐山063000; 2.河北聯合大學生命科學學院，河北唐山063000)

黑豆，為豆科植物大豆的干燥種子，兼有藥食兩用的作用。我國各地均有栽培，尤以山西、河北、陜西較多。黑豆含有豐富的蛋白質、脂肪、維生素、胡蘿卜素、微量元素和粗纖維。《本草綱目拾遺》記載黑豆“服之能益精補髓，壯力潤肌，發白后黑，久則轉老為少，終其身無病”。現代科學研究表明黑豆具有降血脂、抗氧化、養顏美容的效果［1］。異黃酮是黃酮類化合物中的一種，主要存在于豆科植物中。大豆異黃酮是大豆生長過程中產生的次生代謝產物。20世紀90年代，對大豆異黃酮的研究成為世界性的研究熱點。研究發現，大豆異黃酮具有防止骨質疏松癥、抗腫瘤、抗氧化、降低膽固醇、預防心血管疾病、改善婦女更年期綜合癥及雌激素樣等作用［2］。超聲波法是利用超聲波產生的機械作用、擴散、熱效應以及空化作用加速生物細胞中有效成分的擴散和浸出。具有提取時間短、有效成分提取率高、成本低、低溫保護熱敏性成分、污染小等優點。目前，關于黑豆異黃酮的研究報道極少，本文以乙醇作為溶劑，采用超聲波法通過單因素實驗和響應面優化，考察了影響黑豆異黃酮提取的因素，確定了最佳提取工藝。并與振蕩提取法進行了比較，同時測定了不同產地黑豆異黃酮的含量，探索不同品種黑豆的黑豆異黃酮提取量的差異。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黑豆 產自吉林、河北、陜北、江西、山東等地黑豆洗凈在60～65℃烘干粉碎過篩分為20、40、60、80、100、120目備用;金雀異黃酮標準品 洛陽市創偉化玻有限公司;95%乙醇 天津市永大化學試劑公司。

722型可見光分光光度計 上海光譜儀器有限公司;BS-124S型電子天平 賽多利斯科學儀器有限公司;101-1AB型干燥箱 天津市泰斯特儀器有限公司;SK5210HP型超聲波清洗器 上海康華生化儀器制造廠;KDF-2311型多功能食品粉碎機 天津市達康電器有限公司;標準分析篩 浙江上虞市華豐五金儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 黑豆異黃酮工藝流程圖 黑豆粉末→乙醇浸泡→超聲波提取→過濾→測定異黃酮含量

1.2.2 繪制標準曲線 準確稱取金雀異黃酮標準品5.00mg，用95%乙醇溶解，定容至50m L容量瓶中。準確吸取標準溶液0.00、0.05、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50m L的溶液于10m L容量瓶中，再分別加入5.0m L 95%乙醇，然后用蒸餾水定容。在波長259nm下測定吸光度。以金雀異黃酮濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線。

得出標準曲線回歸方程:Y=1606.9966X-0.013 (R2=0.9980)

1.2.3 異黃酮提取率的計算 黑豆異黃酮提取液在波長259nm下測定吸光度，根據標準曲線，得異黃酮的濃度［3］。

1.2.4 單因素實驗設計 分別以乙醇濃度、粒度、液料比、提取時間、溫度、提取次數為單因素進行實驗，探討其對黑豆異黃酮提取率的影響。

稱取8份粒度為80目的黑豆粉5.0000g，按液料比20∶1(m L/g)分別加入濃度為30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%乙醇溶液，在室溫下浸泡2h，然后在50℃下超聲處理20min。

稱取顆粒粒度為20、40、60、80、100、120目黑豆粉各5.0000g，按液料比20∶1(m L/g)加入60%乙醇溶液，在室溫下浸泡 2h，然后在 50℃下超聲處理20m in。

稱取9份100目黑豆粉5.0000g，按液料比10∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1、45∶1、50∶1加入60%乙醇溶液，在室溫下浸泡 2h，然后在 50℃下超聲處理20m in。

稱取7份100目黑豆粉5.0000g，按液料比45∶1加入60%乙醇溶液，在室溫下浸泡2h，在溫度20、30、40、50、60、70℃，超聲處理20m in。

稱取6份100目黑豆粉5.0000g，按液料比45∶1加入60%乙醇溶液，在室溫下浸泡2h，在50℃超聲處理10、20、30、40、50、60m in。

稱取 100目黑豆粉 5.0000g，按液料比 45∶1 (m L/g)加入60%乙醇溶液，在室溫下浸泡2h，在50℃超聲處理50m in，冷卻，過濾，再同樣條件下分別超聲處理1、2、3、4、5次。

1.2.5 響應面分析 在單因素實驗結果基礎上，根據Box-Behnken實驗設計原理，選擇液料比、提取時間、溫度進行三因素三水平的中心組合實驗見表1，利用Design-expert軟件進行響應面分析，確定超聲波法提取黑豆異黃酮的最佳工藝參數。

表1 三因素三水平中心組合實驗因素水平編碼表Table1 Three factors and three levels of central composite experiment factor level table

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果與分析

2.1.1 乙醇濃度對黑豆異黃酮提取效果的影響 由圖1可以看出，隨著乙醇濃度的增加，黑豆異黃酮的提取率隨之增加。在乙醇濃度高于60%以后曲線平緩，提取率的增加相對較小。因為黃酮類化合物易溶于乙醇，乙醇濃度高有利于顆粒中物質滲透溶解，而乙醇濃度過大時，蛋白質，糖類等易溶于水的大分子會在乙醇溶液中發生凝聚，使提取液變稠，影響了黃酮的快速擴散溶出，提取率的增加減少。從經濟方面考慮，選擇60%為最適乙醇濃度。

圖1 乙醇濃度對黑豆異黃酮提取率的影響Fig.1 Effect of ethanol concentrations on yield of isoflavone from black soybean

2.1.2 顆粒粒度對黑豆異黃酮提取效果的影響 由圖2可以看出，隨著粒度增加，黑豆異黃酮提取率也隨之增加，粒度為100目時，異黃酮提取率最大;粒度大于100目時，隨著粒度的增加異黃酮提取率下降。這說明，在一定粒度范圍內，隨粒度的增加黃酮的溶解性增強，但粒度過細，會使黃酮在樣品顆粒表面的吸附增加，從而降低其在溶劑中的溶解性。因而選擇100目為最適粒度。

2.1.3 液料比對黑豆異黃酮提取效果的影響 由圖3可知，隨著液料比的增加，黑豆異黃酮提取率也隨著增加，液料比為45∶1(m L/g)時，異黃酮的提取率達到最大值;之后隨著液料比的增大，異黃酮提取率隨之下降，原因是液料比過大使溶劑的量過多時，會導致其他雜質的過多溶出，從而影響異黃酮溶解。因而最適液料比選擇為45∶1(m L/g)。

圖2 顆粒粒度對黑豆異黃酮提取率的影響Fig.2 Effect of particle sizes on yield of isoflavone from black soybean

圖3 液料比對黑豆異黃酮提取效果的影響Fig.3 Effect of liquid to solid ratios on yield of isoflavone from black soybean

2.1.4 提取溫度對黑豆異黃酮提取效果的影響 由圖4可以看出，隨著提取溫度的升高，黑豆異黃酮提取率也隨之升高。溫度為50℃時異黃酮提取率最大，溫度大于50℃時，提取率反而下降。可能是由于高溫會破壞異黃酮的結構，影響異黃酮的提取效果。因此選擇50℃為最適提取溫度。

圖4 溫度對黑豆異黃酮提取效果的影響Fig.4 Effect of temperature on yield of isoflavone from black soybean

2.1.5 提取時間對黑豆異黃酮提取效果的影響 由圖5可見，隨著提取時間的增加，黑豆異黃酮的提取率會隨之增加。增加提取時間會使物質能更加充分的溶解，使顆粒中物質溶解完全，但在50m in后提取率的增加相對較小，只會增加提取的成本，從經濟以及操作方面考慮，因此選擇50m in為最適提取時間。

圖5 時間對黑豆異黃酮提取效果的影響Fig.5 Effect of time on yield of isoflavone from black soybean

2.1.6 提取次數對黑豆異黃酮提取效果的影響 由圖6可以看出，隨著提取次數的增加異黃酮的提取率也增加。提取次數會使顆粒中物質溶解更為完全，提取更為充分，從經濟與操作方面考慮。因此選擇2次為最適提取次數。

圖6 提取次數對黑豆異黃酮提取效果的影響Fig.6 Effect of extraction times on yield of isoflavone from black soybean

2.2 響應面結果與分析

2.2.1 回歸模型的建立與分析 根據Box-Benhnken中心組合實驗設計原理，結合單因素實驗的結果，選取影響黑豆異黃酮提取率的主要因素(液料比、時間、溫度)進行三因素三水平中心組合實驗，利用響應面分析方法優化的黑豆異黃酮提取工藝參數，實驗方案與結果見表2。

根據表2數據，利用軟件Design Expert進行液料比、提取溫度、提取時間三個因素對黑豆異黃酮提取率影響的回歸分析，建立三元二次響應面回歸方程:

從表3可知，回歸方程極顯著，預測值與實驗值具有高度的相關性(R2=0.9841)。擬合程度＞90%，說明模型能夠反映響應值的變化，說明這種實驗方法可靠，使用該方程模擬真實的三因素三水平的分析可行。失擬項差異不顯著，說明殘差均由隨機誤差引起;由表3中可知，液料比、提取溫度的一次項和二次項對黑豆異黃酮的提取率的影響極顯著或顯著;提取時間的二次項對黑豆異黃酮的提取率的影響極顯著，而一次項不顯著。表明實驗因素對響應值不是簡單的線性關系，而是一種非線性關系。因此，可以用此模型來分析和預測超聲波法提取黑豆異黃酮的工藝條件。而各因素的交互作用對黑豆異黃酮提取率的影響不顯著。

表2 三因素三水平中心組合實驗方案及結果Table2 Three factors and three levels of central composite experiment scheme and results

2.2.2 黑豆異黃酮提取工藝響應面分析與優化 響應曲面反映了當液料比、提取溫度、提取時間三個因素的任意變量取零點水平的時候，其它兩個因素的交互作用對黑豆異黃酮提取率的影響情況。曲面陡表明該因素對提取率的影響顯著，曲面平緩表明該因素對提取率的影響不顯著;等高線的形狀反映兩因素交互作用的強弱，橢圓形表明交互作用強，影響顯著，圓形則相反;等高線密集表明對提取率影響較大，稀疏表明影響較小。

2.2.2.1 液料比與提取溫度的交互作用 從圖7可看出，液料比的曲面較陡，溫度的曲面較平緩，說明液料比對異黃酮提取率的影響顯著，提取溫度的影響不顯著;圖7中等高線沿液料比軸向較溫度軸向密集，說明液料比對異黃酮提取率的影響比溫度大;等高線為圓形，說明兩因素的交互作用較弱，對黃酮提取率的影響不顯著。

圖7 液料比與提取溫度的交互作用對提取率的影響Fig.7 Interaction effect of liquid to solid ratios and extraction temperature on yield of isoflavone from black soybean

2.2.2.2 液料比與提取時間的交互作用 從圖8可看出，液料比的曲面較陡，提取時間的曲面較平緩，說明液料比對異黃酮提取率的影響顯著，提取時間的影響不顯著;圖8中等高線沿液料比軸向較時間軸向密集，說明液料比對異黃酮提取率的影響比時間大;等高線為圓形，說明兩因素的交互作用較弱，對異黃酮提取率的影響不顯著。

2.2.2.3 提取溫度與提取時間的交互作用 從圖9中可看出，提取溫度和提取時間的曲面都比較平緩，說明這兩個因素對異黃酮提取率的影響均不顯著;圖9中等高線沿溫度軸向較時間軸向密集，說明溫度對異黃酮提取率影響比時間大;等高線為圓形，說明兩因素的交互作用較弱，對黃酮提取率的影響不顯著。

圖8 液料比與提取時間的交互作用對提取率的影響Fig.8 Interaction effect of liquid to solid ratios and extraction time on yield of isoflavone from black soybean

圖9 提取溫度與提取時間的交互作用對提取率的影響Fig.9 Interaction effect of the extraction temperature and extraction time on yield of isoflavone from black soybean

2.3 黑豆異黃酮最佳提取條件的確定和驗證實驗

綜上所述，在選取的各因素范圍內，影響黑豆異黃酮提取效果的因素由強到弱依次為液料比、溫度、提取時間。根據回歸模型通過Design-Expert軟件分析得出，以60%乙醇為提取劑、顆粒粒度100目、連續提取2次條件下，超聲波法提取黑豆異黃酮的最佳條件為液料比 45.74∶1(m L/g)、提取時間50.86min、溫度為52.01℃，黑豆異黃酮提取率的預測值為1.891%。考慮到實際情況，確定最佳提取工藝條件為:液料比46∶1(m L/g)、溫度52℃、提取時間51m in。在此條件下進行三次平行實驗，實際平均值為1.883%，與預測值偏差較小，說明該回歸方程與實際情況擬合較好，充分驗證了所建模型的正確性，說明響應面法適用于對超聲波法提取黑豆異黃酮的工藝進行回歸分析和參數優化。

2.4 不同產地的黑豆異黃酮的測定

超聲波提取法:準確稱取粒度為100目的樣品一定量，按液料比46∶1加入60%乙醇，室溫浸泡2h，52℃超聲處理51m in，連續處理2次。

由表4可以看出，在最佳提取條件下對不同產地的黑豆異黃酮含量進行了測定，結果顯示產地為吉林的黑豆異黃酮含量最高。

表4 不同產地黑豆異黃酮的測定Table4 Determination of isoflavone from black soybean in different producing areas

3 結論

以產于吉林的黑豆為材料，采用超聲波法對黑豆異黃酮的提取工藝進行了研究。在單因素實驗的基礎上，利用Design Expert軟件進行實驗設計，采用響應面法對黑豆異黃酮提取的工藝條件建立二次多項式數學模型，對各因素對響應值的影響進行分析。結果表明，實驗誤差小，模型擬合度高，考慮到實際情況，最佳的提取工藝條件可校正為在乙醇濃度60%、粒度100目、液料比46∶1(m L/g)、溫度52℃、提取時間51m in、提取2次，此工藝條件下黑豆異黃酮的提取率為1.883%，與預測值1.891%相差較小。此實驗表明超聲波提取黑豆異黃酮比傳統的振蕩提取法要更經濟、快捷、高效，在異黃酮提取應用范圍內越來越受到重視。同時根據最佳提取工藝測定了其他四個產地的黑豆異黃酮含量，結果表明，產于吉林的黑豆異黃酮含量最高，產于山西的黑豆異黃酮含量最低。

［1］張晨，楊曉泉，唐傳核.大豆異黃酮的熱水提取及其純化工藝的優化［J］.食品研究與開發，2005，26(5):77-80.

［2］李南薇，唐曉恩，鐘銀鏈.大豆異黃酮提取和應用研究進展［J］.廣東農業科學，2010(5):118-120.

［3］王瑩，翟登攀，馬冬云，等.超聲波及微波提取豆粕中總黃酮的工藝優化［J］.佳木斯大學學報:自然科學版，2009，27 (3):468-470.