響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波輔助提取沙棗果總黃酮工藝

羅 麗，梁 琪，張 炎，米 蘭

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州730070)

沙棗(Elaeagnus angustifolia L.)又名銀柳、七里香、桂香柳等，在我國主要分布在西北、華北、東北等地區(qū)，其果實(shí)富含糖類、蛋白質(zhì)、脂類、黃酮和有機(jī)酸等，具有健胃、止瀉、利尿、排毒、去濕熱，降血壓、血糖、血脂等保健功能，是我國新疆和伊朗、土耳其民間治療惡心、嘔吐和胃脹的傳統(tǒng)藥方［1-3］。研究發(fā)現(xiàn)，沙棗果實(shí)中富含黃酮類化合物(flavonoid)，黃酮類化合物又名生物類黃酮，屬植物次級(jí)代謝產(chǎn)物，廣泛存在于蔬菜、水果及谷物中，主要包括黃酮、黃烷酮和黃酮醇等，大部分是以糖甙形式存在，部分以甙元形式存在，具有抗氧化、防癌、抗炎、抗過敏，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫、內(nèi)分泌系統(tǒng)以及預(yù)防肥胖癥、糖尿病等作用，在食品、藥品、化妝品等方面有較大應(yīng)用價(jià)值［4-6］。國內(nèi)外對(duì)其他來源黃酮的提取及應(yīng)用有很多研究報(bào)道，但沙棗果中黃酮的提取及應(yīng)用卻鮮見報(bào)道。超聲波輔助有機(jī)溶劑提取能夠強(qiáng)化提取過程，提高有效成分的溶出速率、縮短提取時(shí)間、節(jié)約成本［7］;響應(yīng)面法(Response surface method)則將多因素實(shí)驗(yàn)中因素與指標(biāo)的相互關(guān)系用多項(xiàng)式擬合，依此研究因素與響應(yīng)面之間、因素與因素之間的相互關(guān)系，因此實(shí)驗(yàn)次數(shù)少，且能夠滿足實(shí)驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)處理的要求，其結(jié)果可信度高，得到國內(nèi)外科研學(xué)者的廣泛利用［8］。本實(shí)驗(yàn)以沙棗果為原料，采用超聲波輔助丙醇提取法，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，運(yùn)用響應(yīng)面法優(yōu)化沙棗果總黃酮的提取工藝，并分析各因素對(duì)沙棗果總黃酮提取率的影響，為沙棗果的進(jìn)一步研究提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

沙棗果 采自甘肅酒泉;蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品 Sigma公司;丙酮、石油醚、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、甲醇、乙醇、乙酸乙酯等 均為分析純。

JY96-ⅡN型超聲波細(xì)胞破碎機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司;HWS26型數(shù)顯恒溫水浴鍋 上海一恒科技有限公司;TDD5M低速離心機(jī) 長沙平凡儀器儀表有限公司;721-3可見分光光度計(jì) 湖南益陽市儀表廠;電子天平 梅特勒-托利多儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 原料預(yù)處理 將沙棗果去除雜質(zhì)、擦凈、曬干、去核，經(jīng)植物粉碎機(jī)粉碎，得到沙棗果肉粉，經(jīng)石油醚脫脂，揮干后備用。

1.2.2 沙棗果總黃酮的測定 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:參照文獻(xiàn)［9］，以蘆丁為對(duì)照品，采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯色體系、分光光度法測定，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。蘆丁含量y(mg/m L)與溶液吸光度A之間建立回歸方程為:y=9.4235x+0.0248，R2=0.9989。

樣品提取率測定:準(zhǔn)確吸取2m L濾液于10m L具塞試管中，加入0.3m L 5%NaNO2溶液，搖勻放置6m in后，加入0.3m L 10%Al(NO3)3溶液，6m in后加入10%NaOH溶液4m L，用蒸餾水定容至刻度，搖勻，15m in后以試劑空白為參比，于510nm處測吸光度值A(chǔ)。總黃酮提取率按公式1計(jì)算:

式中:C為經(jīng)吸光度值計(jì)算出的總黃酮濃度(mg/m L);V為測定時(shí)吸取的試液體積(m L);250為稀釋倍數(shù);m為樣品質(zhì)量(g)。

1.2.3 沙棗果總黃酮提取及響應(yīng)面設(shè)計(jì)

1.2.3.1 沙棗果總黃酮提取條件的初步確定［10-11］

采用單因素實(shí)驗(yàn)考察提取劑、粒徑、提取次數(shù)、提取劑濃度、料液比、水浴時(shí)間、浸提溫度、超聲時(shí)間對(duì)沙棗果總黃酮提取率的影響。準(zhǔn)確稱取1.000g干燥至恒重的沙棗果粉于50m L燒杯中，加入提取劑置于超聲波細(xì)胞破碎機(jī)提取，4000 r/m in離心10m in過濾，定容至50m L容量瓶，搖勻，靜置。吸取5m L提取液于25m L容量瓶進(jìn)行稀釋，取2m L稀釋液按照1.2.2的方法進(jìn)行測定。

1.2.3.2 全因子實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)［12］在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行Plackett-burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)粒徑(A)、水浴時(shí)間(B)、提取劑濃度(C)、料液比(D)、浸提溫度(E)、超聲時(shí)間(F)6個(gè)因素，以提取液吸光度為響應(yīng)值進(jìn)行二級(jí)水平實(shí)驗(yàn)，篩選出對(duì)提取率有顯著影響的因素，其水平編碼表見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素及其編碼水平Table1 Factors and levels in response surface design

1.2.3.3 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)［13］根據(jù)全因子實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果，利用多元一次方程回歸系數(shù)的符號(hào)和大小，設(shè)計(jì)顯著因素的最陡上升路徑，以實(shí)驗(yàn)值變化的梯度方向?yàn)榕榔路较颍鶕?jù)各因素效應(yīng)值的大小確定變化步長，有效逼近最大理想?yún)^(qū)域。

1.2.3.4 中心組合設(shè)計(jì)［14-15］以Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)篩選的三個(gè)顯著因素，結(jié)合最陡爬坡實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定的實(shí)驗(yàn)水平進(jìn)行響應(yīng)面分析。利用統(tǒng)計(jì)軟件design-expert8.05對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 提取溶劑對(duì)總黃酮提取率的影響 由圖1可知，丙酮的提取效果最好，這是由于黃酮類化合物的極性較小，易溶于極性中等或中等偏下的溶劑。根據(jù)“相似相溶原理”，沙棗果總黃酮的極性與丙酮較接近，因此更容易浸出。

圖1 提取溶劑對(duì)總黃酮提取率的影響Fig.1 Effect of extraction solvent on extraction yield of total flavonoids

2.1.2 粒徑對(duì)總黃酮提取率的影響 圖2表明，采用不同粒徑的沙棗果粉，總黃酮的提取率不同。粒徑越小(目數(shù)越大)，總黃酮提取率越高;但粒徑過小時(shí)，提取率反而降低。一方面，隨著粉體粒徑的減小，破碎所需的能量增大，物料因產(chǎn)生熱量而溫度升高;另一方面，當(dāng)粉體粒徑過小時(shí)，離心沉降變得困難、費(fèi)時(shí)，殘留的濾液過多，造成總黃酮成分的損失，所以顆粒徑不宜太小，以80目較適宜。

圖2 粒徑對(duì)總黃酮提取率的影響Fig.2 Effect of crush treatment on extraction yield of total flavonoids

2.1.3 提取次數(shù)對(duì)總黃酮提取率的影響 由表2可以看出，其他條件恒定，超聲處理后，提取2次時(shí)沙棗果總黃酮提取率為3.004%，第3次提取時(shí)，提取液的吸光度很小，與前兩次吸光度相比差異較大，總黃酮提取率增加不明顯，故選擇提取2次為宜。

表2 提取次數(shù)的確定Table2 Determination of extraction times on extraction yield of total flavonoid

2.1.4 料液比對(duì)總黃酮提取率的影響 由圖3可知，料液比在1∶10～1∶25(g/m L)之間時(shí)，隨液體比例的增加，總黃酮提取率逐漸增大，當(dāng)料液比為1∶25(g/m L)時(shí)提取率達(dá)到最大3.256%，之后總黃酮提取率呈迅速下降趨勢。一般增加溶劑的量可以使細(xì)胞壁內(nèi)外濃度差增大，有利于有效成分的溶出，當(dāng)料液比小于1∶25(g/m L)后，由于傳質(zhì)效率已趨于最大，總黃酮提取量達(dá)到飽和，再增大溶劑量，其吸光度值降低，因此確定料液比為1∶25(g/m L)。

圖3 料液比對(duì)總黃酮提取率的影響Fig.3 Effect of liquid-solid ratio on extraction yield of total flavonoids

圖4 提取劑濃度對(duì)總黃酮提取率的影響Fig.4 Effect of acetone concentration on extraction yield of total flavonoids

2.1.5 提取劑濃度對(duì)總黃酮提取率的影響 以1∶25 (g/m L)的料液比，考察不同丙酮濃度對(duì)總黃酮提取率的影響。由圖4可得，隨丙酮濃度的增大，總黃酮提取率也隨之增大;當(dāng)濃度為70%時(shí)，總黃酮提取率達(dá)最大3.362%，但隨著濃度的進(jìn)一步增大，總黃酮提取率反而降低。在超聲過程中，有機(jī)溶劑對(duì)細(xì)胞膜的破壞作用強(qiáng)于水，這是總黃酮提取率增大的一個(gè)原因;另一方面，由于黃酮是一大類物質(zhì)，其極性和化學(xué)性質(zhì)的不同導(dǎo)致部分水溶部分醇溶，且在不同濃度下的溶解度不同，當(dāng)濃度繼續(xù)增大時(shí)，溶液極性相對(duì)偏高，從而導(dǎo)致黃酮溶解度降低。

2.1.6 水浴時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響 由圖5可得，在其他條件恒定時(shí)，沙棗果總黃酮的提取率在水浴時(shí)間20～40min之間，隨時(shí)間延長呈現(xiàn)先增后降的趨勢，當(dāng)水浴 30m in時(shí)，總黃酮提取率達(dá)最大3.223%。因此，處理30m in為最佳水浴浸提時(shí)間。

圖5 水浴時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響Fig.5 Effect of extraction time of water bath on extraction yield of total flavonoids

2.1.7 浸提溫度對(duì)總黃酮提取率的影響 由圖6可知，總黃酮提取率受溫度影響較大，隨溫度的升高，提取率先增后降，45℃時(shí)達(dá)到最大3.342%。隨溫度升高，分子運(yùn)動(dòng)速度加快，有效成分滲透和溶解速度加快，從而可以提高黃酮類物質(zhì)的溶出速率，但當(dāng)溫度升高到一定程度時(shí)，黃酮類物質(zhì)的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，雜質(zhì)溶出量增加，導(dǎo)致總黃酮提取率有所降低［16］。

圖6 浸提溫度對(duì)總黃酮提取率的影響Fig.6 Effect of extraction temperature on extraction yield of total flavonoids

2.1.8 超聲時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響 由圖7可知，總黃酮提取率隨超聲處理時(shí)間延長呈先增后降趨勢。隨超聲時(shí)間延長，提取溶劑溫度不斷升高，使黃酮類物質(zhì)分解，原料中其它成分溶出率提高，并且時(shí)間越長耗能越多，故最終選取25min為最佳提取時(shí)間。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化沙棗果黃酮超聲提取工藝

2.2.1 全因子實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)行Plackett-burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，考察粒徑(A)、水浴時(shí)間(B)、提取劑濃度(C)、料液比(D)、浸提溫度(E)、超聲時(shí)間(F)6個(gè)因素對(duì)沙棗果總黃酮提取率的影響，以提取液吸光度為響應(yīng)值，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。

根據(jù)表3實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果進(jìn)行回歸模型方差分析，結(jié)果見表4，得到回歸方程為:Y=0.59+3.750× 10-4A+3.158×10-3B+7.558×10-3C+0.014D-0.026E+0.014F，其p=0.0216＜0.05，因此該模型的相關(guān)性良好。由表4分析結(jié)果可以看到，各因素中對(duì)總黃酮提取率影響顯著的因素為料液比、浸提溫度、超聲時(shí)間，可作為進(jìn)一步優(yōu)化的條件。

圖7 超聲時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響Fig.7 Effect of ultrasonic treatment time on extraction yield of total flavonoids

表3 Plackett-burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)值表Table3 Experimental design of Plackett-burman and response value table

表4 Plackett-burman實(shí)驗(yàn)因素水平主效應(yīng)分析Table4 Analysis ofmain effect on Plackett-burman test factor levels

2.2.2 最陡爬坡實(shí)驗(yàn) 根據(jù)2.2.1得到的回歸方程和表4的分析結(jié)果來確定最陡爬坡方向。料液比(D)、浸提溫度(E)和超聲時(shí)間(F)對(duì)總黃酮提取率的影響最顯著，其中D和F系數(shù)為正，E系數(shù)為負(fù)，說明適當(dāng)增大料液比和延長超聲時(shí)間、降低浸提溫度可以增加總黃酮提取率，以單因素實(shí)驗(yàn)的中心點(diǎn)為最陡爬坡實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)起點(diǎn)，結(jié)果見表5。

表5 總黃酮提取爬坡實(shí)驗(yàn)及結(jié)果Table5 Design and results of the steepest ascent experiment of total flavonoids

2.2.3 中心組合設(shè)計(jì)及結(jié)果 以最陡爬坡實(shí)驗(yàn)的最優(yōu)值為中心，進(jìn)行二次旋轉(zhuǎn)中心組合設(shè)計(jì)，設(shè)計(jì)共20個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)，其中14個(gè)析因點(diǎn)，6個(gè)中心點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表6。

表6 響應(yīng)面分析方案及實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table6 Design scheme and results of responce surface analysis

通過Design-expert8.05軟件進(jìn)行二次響應(yīng)面回歸分析，得到回歸方程為:Y=3.80-0.022D-0.091E+0.12F+0.083DE-0.043EF-8.765×10-3EF-0.25D2-0.42E2-0.21F2。對(duì)該方程及各因素進(jìn)行方差分析，回歸方程的有效性及各因素對(duì)提取率的影響程度結(jié)果見表7。

從表7方差分析結(jié)果可以看出，該模型極顯著(p=0.0004＜0.01)，且失擬項(xiàng)不顯著(p=0.1306＞0.05)，其決定系數(shù)R2=0.9100，說明回歸方程的擬合程度較好，其響應(yīng)值的變化有91%與所選變量有關(guān)，該模型具有實(shí)際應(yīng)用意義。

從回歸方程各項(xiàng)方差分析結(jié)果看出，D2、E2、F2對(duì)總黃酮提取率的影響極顯著，F(xiàn)對(duì)總黃酮提取率的影響顯著。可見:實(shí)驗(yàn)各因素對(duì)總黃酮提取率的影響不是簡單的線性關(guān)系，各因素對(duì)沙棗果總黃酮提取率影響大小順序?yàn)?超聲時(shí)間＞浸提溫度＞料液比。

表7 響應(yīng)面回歸模型方差分析Table7 ANOVA of the constructed response surface regression model

2.2.4 響應(yīng)曲面的擬合以及最佳操作點(diǎn)的確定 圖8～圖10是由多元二次回歸方程所做的各因素之間兩兩相互作用對(duì)沙棗果總黃酮提取率的影響響應(yīng)面圖。由此可見，響應(yīng)值(總黃酮提取率)隨料液比、浸提溫度和超聲時(shí)間增大呈先增后降的趨勢，說明三個(gè)因素在所選范圍內(nèi)能產(chǎn)生最佳的響應(yīng)值。由圖8可知，在超聲時(shí)間26m in、浸提溫度不變時(shí)，隨料液比增大，提取率先升高后緩慢降低;超聲時(shí)間26min、料液比不變時(shí)，隨浸提溫度升高，提取率先增大后迅速降低，說明料液比對(duì)響應(yīng)值的影響比浸提溫度大。由圖9可知，在料液比1∶26(g/m L)、超聲時(shí)間不變時(shí)，隨浸提溫度升高，提取率先增大后降低;在料液比1∶26(g/m L)、浸提溫度不變時(shí)，隨超聲時(shí)間延長，提取率先增大后緩慢降低，說明超聲時(shí)間對(duì)響應(yīng)值的影響較浸提溫度大。

圖8 料液比和浸提溫度對(duì)總黃酮提取率的影響Fig.8 Response surface plot for effects of liquid-solid ratio and extraction temperature on extraction yield of total flavonoids

通過中心組合設(shè)計(jì)對(duì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行結(jié)果優(yōu)化，得出最佳提取條件為:料液比1∶25.63(g/m L)，浸提溫度42.03℃，超聲時(shí)間27.19min，此條件下黃酮提取率預(yù)測值為3.827%。

圖9 浸提溫度和超聲時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響Fig.9 Response surface plot for effects of extraction temperature and ultrasonic treatment time on extraction yield of total flavonoids

2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

為檢驗(yàn)響應(yīng)面法所得結(jié)果的可靠性，采用上述優(yōu)化條件進(jìn)行沙棗果總黃酮提取。考慮到實(shí)際操作的便利，將提取工藝參數(shù)修正為料液比1∶25.5(g/m L)，浸提溫度42℃，超聲時(shí)間27min，在此提取工藝條件下，得樣品平均提取率為3.91%，比單因素實(shí)驗(yàn)得出的最大值3.362%高出0.548%，與預(yù)測值相符度為98%，說明實(shí)驗(yàn)結(jié)果與模型符合良好，因此，基于響應(yīng)面法分析所得的優(yōu)化提取工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠，具有實(shí)際參考價(jià)值。

3 結(jié)論

以沙棗果為原料，通過單因素實(shí)驗(yàn)，評(píng)價(jià)了提取溶劑、粒徑、提取次數(shù)、提取劑濃度、料液比、浸提時(shí)間、浸提溫度、超聲時(shí)間等對(duì)沙棗果總黃酮提取率的影響。用Design-expert 8.05進(jìn)行P-B實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、爬坡實(shí)驗(yàn)和中心組合設(shè)計(jì)，得出超聲波輔助丙酮溶劑提取沙棗果總黃酮的最佳提取工藝條件為:料液比1∶25.5(g/m L)，浸提溫度42℃，超聲時(shí)間27m in，此條件下預(yù)測沙棗果總黃酮提取率為3.827%。實(shí)際測得的總黃酮提取率為3.91%，與模型的預(yù)測值基本相符，因此認(rèn)為經(jīng)優(yōu)化后的提取條件合理可行。

［1］Klich MG.Leaf variations in Elaeagnus angustifolia related to environmental heterogeneity［J］.Environmental and Experimental Botany，2000，44:171-183.

［2］常兆豐，屠振棟.沙棗資源開發(fā)研究綜述［J］.林業(yè)科技開發(fā)，1993(2):38-40.

［3］KARAMIO，PIRIK，BAHMANIR.Plant regeneration through callus cultures derived from immature-cotyledon explants of oleaster(Elaeagnus angustifolia L.)［J］.Trees-Structure and Function，2009，23(2):335-338.

［4］HEIM KE，TAGLIAFERRO A R，BOBILY D.Flavonoid antioxidants:chemistry，metabolism and structure-activity relationships［J］.The Journal of Nutritional Biochemistry，2002，13 (10):572-584.

［5］CHEN Jia，LI Ya，YANG Liqiong.Biological activities of flavonoids from pathogenic-infected Astragalus adsurgens［J］.Food Chemistry，2012，131:546-551.

［6］YASMINE S，JOHANNE S，DANIEL S，et al.Improved antiangiogenic and antitumour activity of the combination of the natural flavonoid fisetin and cyclophosphamide in Lewis lung carcinoma-bearing mice［J］.Cancer Chemotherapy and Pharmacology，2011，68(2):445-455.

［7］ZHANG Huafeng，YANG Xiaohua，ZHAO Lidong，et al.Ultrasonic-assisted extraction of epimedin C from fresh leaves of Epimedium and extraction mechanism［J］.Innovative Food Science and Emerging Technologies，2009，10(1):54-60.

［8］YAN Yunliang，YU Chenhuan，CHEN Jing，et al.Ultrasonicassisted extraction optimized by response surface methodology，chemical composition and antioxidant activity of polysaccharides from Tremellamesenterica［J］.Carbohydrate Polymers，2011，83: 217-224.

［9］李鵬婧，柳旭光，龍海榮，等.超聲波輔助提取菱角殼總黃酮及抗氧化性研究［J］.食品科技，2011，36(1):167-171.

［10］YING Zhi，HAN Xiaoxiang，LI Jianrong.Ultrasound-assisted extraction of polysaccharides from mulberry leaves［J］.Food Chemistry，2011，127(3):1273-1279.

［11］SUN Yinshi，LIU Zhengbo，WANG Jianhua.Ultrasoundassisted extraction of five isoflavones from Iris tectorum Maxim［J］.Separation and Purification Technology，2011，78(1): 49-54.

［12］DEKA D，BHARGAVIP，SHARMA A，etal.Enhancementof cellulase activity from a new strain of bacillus subtilis bymedium optimization and analysis with various cellulosic substrates［J］.Enzyme Research，2011，2011:151656-151662.

［13］DJOUDI W，AISSANI-BENISSAD F，BOUROUINABACHA S.Optimization of copper cementation process by iron using central composite design experiments［J］.Chemical Engineering Journal，2007，133:1-6.

［14］SUN Yongxu，LIU Jicheng.Application of response surface methodology for optimization of polysaccharides production parameters from the roots of Codonopsis pilosula by a central composite design［J］.Carbohydrate Polymers，2010，80(3): 949-953.

［15］JULIAN L，LIMA V R，LARA Q，et al.Clean recovery of antioxidant flavonoids from citrus peel:Optimizing an aqueous ultrasound-assisted extractionmethod［J］.Food Chemistry，2010，119:81-87.

［16］MIHAELA B，RODICA O，DANA M，et al.Thermal stability of new vanadyl complexes with flavonoid derivatives as potential insulin-mimetic agents［J］.JTherm Anal Calorim，2010，99(3): 823-827.