一種新型血紅蛋白色素制品穩定性的研究

歐秀瓊，景紹紅，黃 萍，宋 凡，張曉春，葛良鵬

(重慶市畜牧科學院，農業部養豬科學重點實驗室，養豬科學重慶市市級重點實驗室，重慶市養豬工程技術研究中心，重慶402460)

在肉制品生產中，亞硝酸鹽是傳統的發色劑和防腐劑，還能使肉制品產生特有的風味和組織結構。但如果加入量過多、攪拌不均勻或者加工工藝不合理，就非常容易導致成品中亞硝酸鹽殘留量過高，造成食物中毒，此外，肉制品中殘留的亞硝酸鹽與人體內蛋白質代謝的中間產物反應會生成致癌物質，正是由于亞硝酸鹽對人體的這些危害作用，多年來各國科學家一直在尋找它的有效替代品，因此部分或全部替代亞硝酸鹽的研究受到了廣泛的關注。由于亞硝酸鹽的發色原理是亞硝基與肌紅蛋白亞鐵離子形成六配位復合物亞硝基肌紅蛋白，因此一般都是將血紅蛋白進行亞硝基化得到櫻桃紅色的亞硝基血紅蛋白作為發色劑添加到肉制品中。不少研究工作者已相繼開展了亞硝基血紅蛋白替代亞硝酸鹽的研究，也取得了一定的研究結果［1-4］，但依然存在亞硝酸鹽殘留問題，同時亞硝基血紅蛋白類色素的穩定性較差，限制了血紅蛋白類色素的使用，因此生產具有穩定性和分散性更好的無硝血紅蛋白將是未來發展的方向。已有的研究表明，煙酰胺、D-異抗壞血酸鈉和糖類對于維持血紅蛋白分子結夠的穩定性均有一定的作用［5］，且這些物質都是目前食品工業允許使用的食用添加劑，因此本研究以亞硝基血紅蛋白作為對照，系統研究煙酰胺、D-異抗壞血酸鈉和糖類復配作用對于血紅蛋白色素穩定性的影響，包括溫度、光照、金屬離子及pH等影響因素，旨在探索一種不含亞硝酸鹽的天然色素，從而替代或部分替代肉制品中亞硝酸鹽的使用，一方面降低肉制品中亞硝酸鹽的殘留量，另一方面提高畜產品的綜合利用價值，產生較好的社會效益和經濟效益。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

豬血 采自榮昌縣屠宰場;檸檬酸三鈉、丙三醇(甘油) 分析純;煙酰胺、D-異抗壞血酸鈉、水溶性殼聚糖、亞硝酸鈉 均為食品級。

FA2004A電子天平 上海精天電子儀器廠; FE20實驗室pH計 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;HH系列恒溫水浴鍋 江蘇金壇中大儀器廠;TDL-50B低速臺式大容量離心機 上海安亭科學儀器廠;TU-1901雙光束紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司;FD-1B-50型冷凍干燥機 上海比朗儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 新型血紅蛋白色素的制備 采集豬血，常規抗凝處理，4～8層紗布過濾抗凝后的血液，除去雜質顆粒，裝入透明容器，于4℃條件下靜置4～8h，血漿和血細胞發生自然沉降分離。傾去上層血漿后，然后加入等體積的蒸餾水，充分攪拌使血細胞破壁，釋放出血紅蛋白。加入終濃度為10mg/m L的甘油，充分攪拌，棕色磨口瓶分裝于4℃條件保存備用。在血紅蛋白液中加入1%煙酰胺和1%D-異抗壞血酸鈉，攪拌均勻后于4℃避光反應24h，再與0.5%水溶性殼聚糖1∶1混合，在50℃條件下加熱5m in，去除未反應、變性的蛋白質，冷凍干燥得新型血紅蛋白色素。

1.2.2 亞硝基血紅蛋白的制備 參照楊錫洪等［6］方法，于1000m L血紅蛋白液中加入0.8g亞硝酸鈉和3.6g D-異抗壞血酸鈉，攪拌均勻后調pH為6.1，于4℃避光反應24h，冷凍干燥得亞硝基血紅蛋白發色劑。

1.2.3 新型血紅蛋白色素的穩定性研究

1.2.3.1 對熱穩定性研究 將制備的新型血紅蛋白色素和亞硝基血紅蛋白凍干樣品配成質量分數為5%水溶液，于恒溫水浴鍋中在70℃條件下分別加熱10、20、30min，冷卻后離心，取上清稀釋20倍過濾，觀察顏色并于540nm處測吸光值。

1.2.3.2 對光穩定性研究 取新型血紅蛋白色素和亞硝基血紅蛋白凍干樣品(2g左右)于試管中并密封，分別置于室內自然光及室內黑暗自條件下觀察色澤變化情況，每隔1周各取0.100g，溶解于50m L蒸餾水中，然后過濾，觀察顏色并于波長540nm處測吸光度A。

1.2.3.3 對金屬離子穩定性研究 分別取0.5g新型血紅蛋白色素和亞硝基血紅蛋白凍干樣品加入10m L濃度為0.1mol/L的五水硫酸銅、七水硫酸亞鐵、七水硫酸鋅、氫氧化鎂、氯化鉀、氯化鈣溶液混勻，黑暗處放置一定時間后(顏色發生變化時)，離心，取上清稀釋20倍過濾，觀察顏色并于540nm處測吸光度A。

1.2.3.4 對 pH穩定性的研究 用1mol/L HCl和0.5mol/L NaOH調節不同pH(5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0)的緩沖液10m L，分別加入0.5g血紅蛋白凍干樣品，室內光照放置一定時間后(顏色發生變化時)，離心，取上清稀釋20倍過濾，觀察顏色并于540nm處測吸光值。

2 結果與分析

2.1 溫度對新型血紅蛋白色素穩定性的影響

溫度對新型血紅蛋白色素穩定性的影響如圖1所示。

選取低溫肉制品加工溫度作為新型血紅蛋白色素熱穩定性的實驗溫度。由圖1可見，隨著加熱時間的延長，新型血紅蛋白色素和亞硝基血紅蛋白的吸光值均呈下降趨勢，在實驗的各個時間點，新型血紅蛋白色素吸光值極顯著高于亞硝基血紅蛋白的吸光值(p＜0.01)，表明新型血紅蛋白色素在低溫肉制品加工中對熱穩定性要優于亞硝基血紅蛋白。

圖1 溫度對新型血紅蛋白色素穩定性的影響Fig.1 Effect of temperature on stability of novel hemoglobin pigment

2.2 光照對新型血紅蛋白色素穩定性的影響

2.2.1 室內自然光線對新型血紅蛋白色素穩定性的影響 室內自然光線對新型血紅蛋白色素穩定性的影響如圖2所示。

圖2 自然光對新型血紅蛋白色素穩定性的影響Fig.2 Effect of natural light on stability of novel hemoglobin pigment

由圖2可見，在室內自然光條件下，隨著貯藏時間的增加，新型血紅蛋白色素和亞硝基血紅蛋白的吸光度均呈下降趨勢，但在各個時間階段，新型血紅蛋白色素的吸光度均極顯著高于亞硝基血紅蛋白(p＜0.01)，表明新型血紅蛋白色素對光的穩定性要優于亞硝基血紅蛋白。

2.2.2 室內黑暗條件下對新型血紅蛋白色素穩定性的影響 室內黑暗條件下對新型血紅蛋白色素穩定性的影響如圖3所示。

由圖3可見，在室內黑暗條件下，新型血紅蛋白色素和亞硝基血紅蛋白隨著貯藏時間的延長，吸光度呈下降趨勢，但各儲藏階段糖基化無硝血紅蛋白的吸光值均高于亞硝基血紅蛋白，且各階段的二者吸光值均高于自然光照組(p＜0.01)，表明在黑暗條件下的儲藏條件要優于自然光照條件。

2.3 金屬離子對新型血紅蛋白色素穩定性的影響

金屬離子對新型血紅蛋白色素穩定性的影響如圖4所示。

由圖4可見，Cu2+、Fe2+、Zn2+對新型血紅蛋白色素及亞硝基血紅蛋白的影響均較大，加入 Cu2+、 Fe2+、Zn2+后吸光度非常低，而Mg2+、K+、Ca2+對新型血紅蛋白色素及亞硝基血紅蛋白的影響較小，在相同條件下，除銅離子無差異顯著外，新型血紅蛋白色素對其余金屬離子的穩定性均顯著優于亞硝基血紅蛋白(p＜0.01)。

圖3 黑暗條件對新型血紅蛋白色素穩定性的影響Fig.3 Stability of novel hemoglobin pigment in dark

圖4 金屬離子對新型血紅蛋白色素穩定性的影響Fig.4 Effect of iron on stability of novel hemoglobin pigment

2.4 pH對新型血紅蛋白色素穩定性的影響

pH對新型血紅蛋白色素穩定性的影響如圖5所示。

由圖5可見，新型血紅蛋白色素及亞硝基血紅蛋白經不同pH緩沖液處理后，其吸光度均無明顯變化，但總的趨勢是新型血紅蛋白色素吸光度高于亞硝基血紅蛋白，除pH6.0條件下，二者無顯著性差異，其余pH條件下，新型血紅蛋白色素吸光度極顯著高于亞硝基血紅蛋白(p＜0.01)。表明兩者在pH5～8范圍內均較穩定。

圖5 pH對新型血紅蛋白色素穩定性的影響Fig.5 Effect of pH on stability of novel hemoglobin pigment

3 結論

新型血紅蛋白色素對溫度、光照、金屬離子的穩定性總體上均優于亞硝基血紅蛋白，但光照以及Cu2+、Fe2+、Zn2+對新型血紅蛋白色素及亞硝基血紅蛋白的影響均較大，而pH5～8范圍內對新型血紅蛋白色素及亞硝基血紅蛋白均無明顯影響。

［1］Shahidi F，Rubin L.Preparation of the cooked cured meat pigment，dinitrosyl ferrohemochrome from hemin and nitric oxide［J］.Journal of Food Science，1985，50(1):272-273.

［2］Shahidi F，Pegg R B.Novel synthesis of cooked curedmeat pigment［J］.Journal of Food Science，1991，56(5):1205-1208.

［3］楊錫洪，夏文水.糖基化亞硝基血紅蛋白色素在灌腸中的應用［J］.食品研究與開發，2005，26(4):100-102.

［4］黃群，馬美湖，麻成金，等.亞硝基血紅蛋白合成研究［J］.肉類工業，2007，309(1):28-31.

［5］Leo ML Nollet，Fidel Toldr.Processing of nitrite-free cured meats，Advanced Technologies For Meat Processing［M］.CRC Press 2006，309-327.ISBN:978-1-57444-587-9.

［6］楊錫洪，解萬翠，王維民，等.穩定性色素—糖基化亞硝基血紅蛋白的研制［J］.食品科學，2007，28(10):204-207.