慢性應激抑郁模型大鼠海馬組織細胞色素C的表達及抗抑郁藥物的干預作用

孔令韜，吳 楓，湯艷清

抑郁癥是一種以情緒低落、思維遲緩、興趣喪失、精力缺乏為主要臨床表現，伴有食欲減退、體質量減輕及睡眠障礙等軀體癥狀的常見精神疾病。應激性生活事件與抑郁癥的發病密切相關，隨著現代社會人們生活壓力的增加，抑郁癥發病率逐漸升高，預計到2020年抑郁癥將成為年發病率位居第2位的疾病［1］。但目前抑郁癥的病因仍不清楚，對其發病的病理生理學機制及抗抑郁藥物的作用機制等方面的研究仍存在著巨大空白。

凋亡是一種受基因調控的程序化細胞死亡，是成年生物體內主動清除病變和衰老細胞，保持機體內環境平衡的重要生物過程，與機體發育、組織自穩定及多種疾病的發病密切相關［2］。近年來的神經生物學研究表明，應激導致的海馬損傷和海馬神經元凋亡增加可能是抑郁癥發病的內在病理生理機制之一［3］。細胞色素C是一種調節蛋白，在細胞凋亡過程中起重要作用，但其在應激導致的海馬神經元凋亡過程中的作用及抗抑郁藥物對其表達的影響尚不清楚。本研究旨在觀察慢性應激抑郁模型大鼠海馬組織細胞色素C的表達并探討兩種不同作用機制抗抑郁藥物氟西汀和噻萘普汀的干預作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 雄性Wistar大鼠60只，體質量180～220 g，均由中國醫科大學實驗動物中心提供，自由飲食水，光暗周期為12 h/12 h，實驗前適應性飼養1周。采用隨機排列表法將大鼠分為對照組、模型組、氟西汀組和噻萘普汀組，每組15只。

1.2 主要儀器及試劑 德國Heidolph公司Diax 900型電動組織勻漿機，德國西格瑪公司Sigma 2－16K型低溫超速離心機。兔抗大鼠細胞色素C抗體由武漢博士德生物工程有限公司提供，生物素標記的山羊抗兔IgG，化學發光 (ECL)試劑盒購自美國圣克魯斯生物技術有限公司。

1.3 方法

1.3.1 模型制備 第1～21天，對照組大鼠正常飼養，模型組、氟西汀組和噻萘普汀組大鼠隨機接受7種不同的刺激:電擊足底 (30～40 V，20 s/次，間隔1 min，共20次);強迫游泳 (水溫20℃，5 min);夾尾 (1 min);搖晃 (水平往復，1次/s，共15 min);熱應激 (45℃恒溫箱，5 min);禁食 (48 h);禁水 (24 h)。每天給予1種刺激，每種刺激累計使用2～3 次［4］。

1.3.2 藥物干預 模型制備期間對大鼠進行刺激前，氟西汀組大鼠采用氟西汀 (20.0 mg/片)10.0 mg/kg灌胃，噻萘普汀組大鼠采用噻萘普汀 (12.5 mg/片)50.0 mg/kg灌胃，對照組和模型組大鼠采用等體積的0.9%氯化鈉溶液灌胃。氟西汀和噻萘普汀使用前先研磨成粉并溶于蒸餾水。

1.3.3 細胞色素C表達水平 第22天將各組大鼠斷頭處死，迅速取腦并剝離海馬組織，4℃保存，加入300 μl裂解液勻漿并在低溫離心機離心，離心半徑 (r)=10 cm，25 000×g，15 000 r/min離心1 h，吸取上清液待測。

采用蛋白印跡法 (Western Blot法)測定細胞色素C的表達，步驟如下:(1)考馬斯亮藍G250法測定細胞色素C水平并加入樣品緩沖液;(2)灌膠、加樣、電泳、轉膜，5%脫脂奶粉封閉液4℃過夜;(3)加入1∶200稀釋的兔抗大鼠細胞色素C抗體，搖床上室溫孵育2 h;(4)加入1:400稀釋的與辣根過氧化物酶結合的山羊抗兔IgG，搖床上室溫孵育2 h;(5)ECL法顯色;(6)曝光，顯影，定影。采用Chemi Imager 5500 V 2.03軟件掃描Western Blot法測定的結果，Fluor Chen 2.0軟件進行定量分析，細胞色素C表達水平以整合光密度值 (IDV)表示。

1.3.4 行為學觀察指標 采用開場法測定各組大鼠模型制備前后5 min內的行為學觀察指標，包括水平穿越格數 (大鼠由中央格開始跑動穿過的格數)、豎立次數 (大鼠前爪同時離開地面超過1 s的次數)、修飾次數 (大鼠用前爪整理胡須的次數);之后進行液體消耗實驗，計算24 h內蔗糖水消耗百分比，即蔗糖水消耗量/總液體消耗量×100%。

1.4 統計學方法 應用SPSS 13.0統計學軟件進行分析，計量資料以 ()表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用q檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 細胞色素C表達水平 對照組大鼠平均IDV值為(24 631±2 194)，模型組為 (38 963±5 384)，氟西汀組為(27 220±2 892)，噻萘普汀組為 (33 204±4 174)，4組大鼠細胞色素C表達水平比較，差異有統計學意義 (F=33.343，P=0.000)。其中模型組、氟西汀組、噻萘普汀組細胞色素C表達水平與對照組比較，差異均有統計學意義 (q值分別為22 151.0、4 001.0和13 250.0，P＜0.05);氟西汀組與模型組比較，差異有統計學意義 (q=18 150.0，P＜0.01)，與噻萘普汀組比較，差異亦有統計學意義 (q=9 248.0，P＜0.05);噻萘普汀組與模型組比較，差異有統計學意義 (q=8 901.0，P＜0.01)。

2.2 行為學觀察指標比較 4組大鼠模型制備前水平穿越格數、豎立次數、修飾次數及蔗糖水消耗百分比比較，差異均無統計學意義 (P＞0.05);制備后比較，差異均有統計學意義(P＜0.05，見表1)。

2.2.1 水平穿越格數 制備后模型組大鼠水平穿越格數與對照組比較，差異有統計學意義 (q=35.2，P＜0.05);氟西汀組、噻萘普汀組與對照組比較，差異均無統計學意義 (q值分別為10.7和27.7，P＞0.05);氟西汀組與模型組比較，差異有統計學意義 (q=24.6，P＜0.05)，與噻萘普汀組比較，差異無統計學意義 (q=17.0，P＞0.05);噻萘普汀組與模型組比較，差異無統計學意義 (q=7.6，P＞0.05)。

2.2.2 豎立次數 制備后模型組、氟西汀組、噻萘普汀組大鼠豎立次數與對照組比較，差異均有統計學意義 (q值分別為18.5、10.7和12.7，P＜0.05);氟西汀組與模型組比較，差異有統計學意義 (q=8.2，P＜0.05)，與噻萘普汀組比較，差異無統計學意義 (q=2.0，P＞0.05);噻萘普汀組與模型組比較，差異無統計學意義 (q=6.2，P＞0.05)。

2.2.3 修飾次數 制備后模型組、噻萘普汀組大鼠修飾次數與對照組比較，差異均有統計學意義 (q值分別為7.4和4.5，P＜0.05);氟西汀組與對照組比較，差異無統計學意義 (q=2.3，P＞0.05);氟西汀組與模型組比較，差異有統計學意義(q=5.1，P＜0.05)，氟西汀組與噻萘普汀組比較，差異無統計學意義 (q=2.2，P＞0.05);噻萘普汀組與模型組比較，差異無統計學意義 (q=2.9，P＞0.05)。

2.2.4 蔗糖水消耗百分比 制備后模型組大鼠蔗糖水消耗百分比與對照組比較，差異有統計學意義 (q=0.2，P＜0.05);氟西汀組、噻萘普汀組與對照組比較，差異均無統計學意義(q值分別為0.04和0.09，P＞0.05);氟西汀組與模型組比較，差異有統計學意義 (q=0.16，P＜0.05)，氟西汀組與噻萘普汀組比較，差異無統計學意義 (q=0.05，P＞0.05);噻萘普汀組與模型組比較，差異有統計學意義 (q=0.11，P＜0.05)。

表1 各組大鼠行為學觀察指標比較 ()Table 1 Comparison of behavior indicators before and after stress in each group

表1 各組大鼠行為學觀察指標比較 ()Table 1 Comparison of behavior indicators before and after stress in each group

.2±3.3 8.4±2.7 70.1±8.7 68.5± 8.2模型組 15 35.3±13.8 23.2±23.0 23.8±5.8 8.1± 7.2 8.8±3.9 3.6±3.5 70.4±6.9 55.4±11.7氟西汀組 15 35.6±13.6 39.1±17.8 24.0±7.4 13.4± 5.0 10.0±4.8 6.9±2.4 72.6±9.1 66.0± 7.3噻萘普汀組 15 38.6±13.6 28.1±23.0 20.5±6.2 12.1± 9.4 7.4±3.4 5.5±3.2 72.8±8.8 62.7±10.6 F制備后對照組 15 37.9±10.9 46.0±18.9 22.6±8.2 20.3±11.3 7組別 只數 水平穿越格數(格)制備前 制備后豎立次數(次)制備前 制備后修飾次數(次)制備前 制備后蔗糖水消耗百分比(%)制備前0.229 3.297 0.591 5.307 1.030 6.644 0.469 4.551 P值 0.921 0.016 0.671 0.001 0.398 0.000 0.759 0.003值

3 討論

慢性輕度不可預見性應激 (CUMS)抑郁模型采用輕度、不可預見的應激因子模擬人類生活事件和環境應激刺激等社會心理因素，與人類抑郁癥中慢性、低水平的應激原促進疾病發生、加速疾病發展的機制更接近，是近年來國內外廣泛應用的探討抑郁癥發病機制及抗抑郁藥物藥理學研究的動物模型之一［4］。本研究結果顯示，模型組大鼠經過21 d的慢性綜合應激，與對照組大鼠相比，活動能力降低、探究行為、修飾次數減少，蔗糖水消耗百分比下降，這些表現與臨床上抑郁癥患者表現的精神運動改變、興趣或快感的喪失有很大程度的相似性，而氟西汀組和噻萘普汀組大鼠行為學表現均好于模型組，表明模型組大鼠的行為改變可以被抗抑郁藥物拮抗。以上結果說明本研究中大鼠抑郁癥模型的制備是成功的［5］。

本研究采用Western Blot法對大鼠海馬組織細胞色素C表達水平進行檢測，結果顯示，經過21 d的慢性應激后，模型組大鼠海馬組織細胞色素C表達水平較對照組升高。細胞色素C是細胞線粒體中的一種水溶性蛋白，能夠通過對凋亡信號的傳導和放大作用來調控細胞凋亡，在細胞凋亡過程中起重要作用:當細胞遭受應激反應或死亡刺激信號后，細胞色素C被釋放到胞質中引發Caspase凋亡通路的級聯反應，最終導致細胞凋亡或壞死［6］。研究表明，長期持續的應激刺激會導致中樞神經系統內的生化環境發生一系列改變，進而顯著增加易感性個體發生抑郁癥等情感障礙的可能性［7］。海馬是大腦內介導應激反應的重要腦區之一，由于海馬神經元在應激時極易受損，因而在抑郁癥發病機制的研究中備受關注［8－9］。近年研究發現，抑郁癥患者海馬的多個亞區存在神經元凋亡，認為應激導致的海馬神經元受損可能與凋亡有關［10］。本研究結果提示，慢性應激可能導致海馬部分神經元細胞色素C釋放增加，細胞色素C的釋放導致海馬神經元凋亡增多進而影響海馬功能，這可能是抑郁癥發病的內在病理生理機制之一。

本研究采用氟西汀和噻萘普汀兩種不同作用機制的抗抑郁藥物在大鼠抑郁癥模型制備過程中進行干預，進一步探討抗抑郁藥物對神經元凋亡過程的影響。結果顯示，經過21 d的慢性應激后，氟西汀組和噻萘普汀組大鼠的細胞色素C表達水平均低于模型組，提示抗抑郁藥物能夠抑制神經元內細胞色素C的釋放，減少神經元凋亡。筆者在前期研究中發現，慢性應激可以導致抑郁模型大鼠海馬組織Bcl－xl表達降低［11］，環腺苷酸反應成分結合蛋白 (CREB)能夠增加Bcl－xl的基因表達并促進細胞存活［12］。在凋亡過程中，B細胞淋巴瘤/白血病－2(B cell lymphoma/lewkmia－2，Bcl－2)家族蛋白參與了對線粒體細胞色素C釋放過程的調節:凋亡抑制蛋白Bcl－2和Bcl－xl能夠穩定線粒體功能，抑制細胞色素C釋放。另外，氟西汀等新型抗抑郁藥物不僅能通過調整神經元突觸間隙的神經遞質濃度起到抗抑郁效果，而且能夠調節大腦神經元內與神經營養因子分泌有關的多種信號通路蛋白的表達，如CREB、蛋白激酶 A(PKA)等［5，13－15］。

綜上所述，抗抑郁藥物可能通過參與多條信號通路的調節，上調凋亡抑制蛋白的表達，抑制神經元內線粒體細胞色素C的釋放以減少應激導致的神經元凋亡，這種神經元保護作用可能是抗抑郁藥物的作用機制之一。神經元凋亡過程可能與抑郁癥的發病和治療有關，對揭示抑郁癥發病的內在病理生理學機制及開發新型抗抑郁藥物有重要意義，但除細胞色素C之外，參與凋亡過程的其他相關蛋白如Apaf－1、Caspase－9等在抑郁癥發病及抗抑郁治療過程中的具體作用有待于進一步的研究。

1 Saraceno B.The WHO World Health Report 2001 on mental health［J］.Epidemiol Psichiatr Soc，2002，11(2):83－87.

2 Kubera M，Obuchowicz E，Goehler L，et al.In animal models，psychosocial stress－induced(neuro)inflammation，apoptosis and reduced neurogenesis are associated to the onset of depression ［J］.Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry，2011，35(3):744 －759.

3 Lucassen PJ，Meerlo P，Naylor AS，et al.Regulation of adult neurogenesis by stress，sleep disruption，exercise and inflammation:implications for depression and antidepressant action ［J］.Eur Neuropsychopharmacol，2010，20(1):1 －17.

4 Willner P，Towell A，Sampson D，et al.Reduction of sucrose preference by chronic unpredictable mild stress，and its restoration by a tricyclic antidepressant［J］.Psychopharmacology(Berl)，1987，93(3):358－364.

5 吳楓，孔令韜，湯艷清.氟西汀和碳酸鋰對慢性應激抑郁模型大鼠海馬腦源性神經營養因子表達的影響［J］.中國全科醫學，2012，15(6):2055.

6 Hüttemann M，Helling S，Sanderson TH，et al.Regulation of mitochondrial respiration and apoptosis through cell signaling:cytochrome coxidase and cytochrome c in ischemia/reperfusion injury and inflammation ［J］.Biochim Biophys Acta，2012，1817(4):598－609.

7 Diamond DM，Campbell A，Park CR，et al.Preclinical research on stress，memory，and the brain in the development of pharmacotherapy for depression ［J］.Eur Neuropsychopharmacol，2004，14(Suppl 5):S491－S495.

8 Jayatissa MN，Bisgaard CF，West MJ，et al.The number of granule cells in rat hippocampus is reduced after chronic mild stress and reestablished after chronic escitalopram treatment［J］.Neuropharmacology，2008，54(3):530－541.

9 Stockmeier CA，Mahajan GJ，Konick LC，et al.Cellular changes in the postmortem hippocampus in major depression ［J］.Biol Psychiatry，2004，56(9):640－650.

10 Duman RS.Synaptic plasticity and mood disorders［J］.Mol Psychiatry，2002，7(Suppl 1):S29－S34.

11 畢波，王哲，彭淼，等.慢性應激對大鼠海馬Bcl－xl表達的影響及應激后的變化 ［J］.中國臨床心理學雜志，2005，13(2):144－146.

12 Rodriguez D，Rojas－Rivera D，Hetz C.Integrating stress signals at the endoplasmic reticulum:the BCL －2 protein family rheostat［J］.Biochim Biophys Acta，2011，1813(4):564－574.

13 孔令韜，吳楓，宋寧，等.慢性應激抑郁模型大鼠海馬cAMP反應元件結合蛋白的表達及氟西汀的干預作用［J］.中國行為醫學科學，2008，17(5):391－393.

14 吳楓，李黎黎，孔令韜，等.慢性應激抑郁模型大鼠海馬蛋白激酶A的變化及抗抑郁藥物的干預作用 ［J］.中華臨床醫師雜志:電子版，2011，5(23):6970－6974.

15 吳楓，孔令韜，湯艷清.抗抑郁藥物對慢性應激抑郁模型大鼠海馬蛋白激酶C表達的干預作用 ［J］.中國全科醫學，2012，15(4):1375.