丙戊酸鈉對胃癌SGC-7901細(xì)胞的放療增敏作用

陳秀萍 楚建軍 王忠超

目前研究認(rèn)為組蛋白去乙酰化酶(HDAC)在胃癌組織中的表達(dá)水平明顯高于癌旁正常黏膜組織，提示HDAC1參與胃癌的發(fā)生發(fā)展。丙戊酸鈉(valproic acid，VPA)已廣泛用于癲癇和精神疾病治療中，越來越多的研究表明，丙戊酸鈉作為組蛋白去乙酰化酶抑制劑具有抗腫瘤的作用，但關(guān)于其在腫瘤放療方面的作用報道較少。本實驗應(yīng)用不同濃度的丙戊酸鈉作用胃癌細(xì)胞系SGC-7901，觀察其細(xì)胞毒性及放射增敏用，并探討其機(jī)制，為丙戊酸鈉應(yīng)用于胃癌放射治療提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑及儀器 人胃癌細(xì)胞株SGC-7901細(xì)胞由蘇州大學(xué)附屬第四人民醫(yī)院腫瘤研究所提供;胎牛血清購自杭州四季青公司，高糖DMEM、胰蛋白酶、四甲基偶氮唑鹽(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)、Giemsa染色、凱基細(xì)胞周期檢測試劑盒均購自南京凱基生物公司;注射用丙戊酸鈉購自南開允公藥業(yè)有限公司。美國Varian公司23EX醫(yī)用直線加速器，F(xiàn)ACS Vantage SE型流式細(xì)胞儀為美國BD公司產(chǎn)品。

1.1.2 細(xì)胞照射方法 應(yīng)用6MV X線等中心照射，機(jī)架旋轉(zhuǎn)180度，源皮距為100 cm，射野大小為10 cm×10 cm，劑量率為200 cGy/min。根據(jù)不同的照射劑量計算相應(yīng)的Mu值。為使劑量平均分布，及細(xì)胞達(dá)最大吸收劑量，照射時其上下各置1.5 cm厚的組織等效填充物。

1.1.3 細(xì)胞培養(yǎng) 將人胃癌細(xì)胞株SGC-7901細(xì)胞置于含有10%胎牛血清、鏈霉素和青霉素各100 U/mL的高糖DMEM培養(yǎng)液中，置于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)至70% ～80%融合時，用PBS洗滌，0.25%胰酶消化傳代繼續(xù)培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實驗。

1.2 方法

1.2.1 MTT法檢測丙戊酸鈉對SGC-7901細(xì)胞抑制率 取對數(shù)生長期SGC-7901細(xì)胞，消化制成細(xì)胞懸液，設(shè)空白組(只有培養(yǎng)液，不含有細(xì)胞和丙戊酸鈉)和對照組(含有細(xì)胞和培養(yǎng)液但不加丙戊酸鈉)，4 000個細(xì)胞/孔接種于96孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h后，棄去舊培養(yǎng)液，加入用DMEM培養(yǎng)液稀釋的200 μL不同濃度的丙戊酸鈉(0.75、1.5、3.0、4.0、8.0 mmol/L)，每個濃度取3個時間點檢測(24、48、72 h)，設(shè)6個復(fù)孔，培養(yǎng)24、48、72 h 后加 MTT 50 μL 再培養(yǎng) 4 h。棄上清，加150 μL DMSO，避光平板搖床震蕩10 min，使結(jié)晶顆粒充分溶解，酶標(biāo)儀檢測各孔490 nm處的吸光度(OD)值。實驗重復(fù)3次。計算各組細(xì)胞增殖抑制率。細(xì)胞增殖抑制率(%)=(1-實驗組OD值/對照組OD值)×100%，根據(jù)半數(shù)抑制濃度(IC50)，計算丙戊酸鈉作用胃癌細(xì)胞株SGC-7901細(xì)胞不同時間點后50%的細(xì)胞生長抑制的濃度，即IC50。上述實驗重復(fù)3次。

1.2.2 細(xì)胞周期檢測 實驗分為4組。對照組:加入不含丙戊酸鈉的培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h;單純放療組:加入培養(yǎng)液培養(yǎng)4 h后進(jìn)行4 Gy照射，繼續(xù)培養(yǎng)44 h;藥物組:加入含3.0 mmol/L的丙戊酸鈉的培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h;聯(lián)合組:加入含3.0 mmol/L的丙戊酸鈉的培養(yǎng)液培養(yǎng)4 h后進(jìn)行4 Gy照射，繼續(xù)培養(yǎng)44 h。收集細(xì)胞1×106/ml，用預(yù)冷的70%乙醇固定，染色前洗去固定液，用 PBS洗 3遍，加 100 μL RNase A 37℃水浴 30 min，加入400 μL PI染色混勻，4℃避光30 min，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測，記錄細(xì)胞周期各時相的百分比，每組重復(fù)3個樣本，取平均值。

1.2.3 細(xì)胞凋亡檢測 實驗分組同1.2.2，收集(1～5) ×105/ml細(xì)胞，加入 500 μL 的 Binding Buffer懸液細(xì)胞，加入5 μL Annexin V-FITC 混勻，加入5 μL PI混勻。室溫避光反應(yīng)15 min，1 h內(nèi)應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用統(tǒng)計軟件包SPSS 17.0進(jìn)行方差分析，計量資料以表示。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度丙戊酸鈉作用不同時間胃癌SGC-7901細(xì)胞抑制率

MTT檢測結(jié)果顯示，丙戊酸鈉可顯著抑制SGC-7901細(xì)胞生長，呈濃度、劑量依賴性(圖1)，各組間比較P＜0.05。根據(jù)丙戊酸鈉對胃癌SGC-7901細(xì)胞的生長抑制率計算其作用24、48、72 h的 IC50分別為19.83、3.67、2.75 mol/L。

圖1 不同濃度丙戊酸鈉對胃癌SGC-7901細(xì)胞的抑制

2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組SGC-7901細(xì)胞周期的分布

SGC-7901細(xì)胞經(jīng)丙戊酸鈉和放療處理后，G0/G1期細(xì)胞比例增大，S期細(xì)胞比例明顯減小，而這種情況在丙戊酸鈉聯(lián)合放療組中更為明顯，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05)(表1)。

表1 FCM檢測SGC-7901細(xì)胞周期分布(，%)

表1 FCM檢測SGC-7901細(xì)胞周期分布(，%)

*為與對照組比較P＜0.05，△為與藥物組比較 P＜0.05，○為與放療組比較，P ＜0.05

/M對照組組別 G0/G1 S G2 10.8 ±0.59 51.0 ±1.55 35.8 ±0.80 13.2 ±1.45藥物組 63.9 ±1.96* 24.3 ±0.81* 11.8 ±0.50放療組 61.7 ±0.54* 26.1 ±0.90* 12.2 ±1.31聯(lián)合組 71.5±0.86＊△○ 17.7±0.77＊△○

2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組SGC-7901細(xì)胞凋亡情況

丙戊酸鈉組、放療組、聯(lián)合組SGC-7901細(xì)胞凋亡率均高于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，且聯(lián)合組凋亡率高于丙戊酸鈉組及放療組(P＜0.05)(表2)。

表2 FCM檢測SGC-7901細(xì)胞凋亡情況(，%)

表2 FCM檢測SGC-7901細(xì)胞凋亡情況(，%)

*為與對照組比較P＜0.05，△為與藥物組比較 P＜0.05，○為與放療組比較P＜0.05

組別 凋亡率(%)2.69 ±0.07藥物組 20.35 ±0.49*放療組 14.89 ±1.13*聯(lián)合組 31.32 ±1.03對照組＊△○

3 討論

胃癌是最常見的惡性腫瘤之一。每年約有60余萬人因胃癌死亡，居癌癥死因的第2位［1］。隨著放射源的發(fā)展，放射生物學(xué)的進(jìn)步以及治療方法的改進(jìn)，特別是直線加速器應(yīng)用于臨床后，已有研究報道，術(shù)后輔助的放療或放化療不僅能提高胃癌的局控率，而且還能提高胃癌患者的生存率［2］。Mayo Clinic組的研究結(jié)果提示:增加放療劑量可以明顯提高胃癌患者的術(shù)后局部控制率和長期生存率。但胃周圍重要器官如肝、小腸、腎和脊髓等對放射線耐受性［3］，限制了治療劑量的提高。由于胃癌對放療的敏感性有限，因此放射增敏劑可以用于增強(qiáng)放療敏感性［4］。

組蛋白乙酰化/去乙酰化及其調(diào)節(jié)酶的異常與胃癌發(fā)生、發(fā)展存在密切的聯(lián)系。其中組蛋白乙酰化酶(HAT)和組蛋白去乙酰化酶(HDAC)是組蛋白乙酰化的關(guān)鍵酶，決定著組蛋白的乙酰化程度，參與腫瘤異常基因表達(dá)。組蛋白去乙酰化酶(HDAC)活性改變與腫瘤的發(fā)生相關(guān)。近期研究發(fā)現(xiàn)，HDAC出現(xiàn)在調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和凋亡的蛋白復(fù)合體中。HDACs調(diào)節(jié)各種組蛋白和非組蛋白的乙酰化，控制基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，參與細(xì)胞周期、增殖、存活、DNA修復(fù)和分化［5］。組蛋白的乙酰化和去乙酰化之間的平衡是調(diào)節(jié)基因表達(dá)的1個重要因素，通常認(rèn)為組蛋白的高乙酰化是活躍轉(zhuǎn)錄染色質(zhì)的1個標(biāo)志，而低乙酰化則與轉(zhuǎn)錄抑制有關(guān)［6］。丙戊酸鈉(VPA)是治療癲癇的1種傳統(tǒng)藥物，毒副作用比較小。近期研究證實其是HDAcs特異性抑制劑之一，能使染色體成阻抑結(jié)構(gòu)而抑制基因的轉(zhuǎn)錄［7］，在體外對于多種腫瘤細(xì)胞系有抑制細(xì)胞增殖作用。因此，增強(qiáng)HAT表達(dá)和(或)降低HDACs表達(dá)就成為腫瘤治療研究的新思路。HDACs抑制劑在治療腫瘤中的作用也日益受到重視。

本實驗觀察選擇性HDAC抑制劑丙戊酸鈉對胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖抑制、細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡，探討其放射增敏機(jī)制。我們將VPA應(yīng)用于胃癌細(xì)胞系SGC-7901，通過體外實驗證實，VPA可明顯抑制胃癌細(xì)胞的生長，并且此抑制作用呈劑量與時間依賴趨勢，G0/G1期細(xì)胞群比例增加，S期細(xì)胞群比例明顯減少，而這種趨勢在丙戊酸鈉聯(lián)合放療組中更為;在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡方面，各試驗組均有不同程度凋亡增強(qiáng)，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，丙戊酸鈉聯(lián)合放療組凋亡趨勢更加明顯。上述結(jié)果表明，丙戊酸鈉、放療均能使細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，且聯(lián)合組對G0/G1期的阻滯作用更加顯著。一般來說，不同時相細(xì)胞的放射敏感性有區(qū)別［8］，G2/M期對放射線最為敏感，其次是G1期，S期則最不敏感。有實驗研究表明，丙戊酸鈉可以通過上調(diào)P21(Waf/cip1)，Mad1的表達(dá)及其下調(diào)Cyclin A，c-Myc的表達(dá)使BGC823細(xì)胞阻滯于G1期，并通過誘導(dǎo)Caspase 9和Caspase 3的活性來調(diào)節(jié)凋亡［9］。

綜上所述，丙戊酸鈉對胃癌細(xì)胞SGC-7901有較好的抑制效果，其機(jī)制可能與丙戊酸鈉改變了細(xì)胞周期分布、增加了放射敏感性有關(guān)。對丙戊酸鈉放療增敏作用及其機(jī)制的進(jìn)一步研究必將為胃癌的治療開辟出新的途徑。

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